一种利用氧载体提高酿酒酵母发酵液中谷胱甘肽效价的方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用氧载体提高酿酒酵母发酵液中谷胱甘肽效价的方法，包括以下步骤：（1）种子制备：将酿酒酵母接种到种子培养基中培养得到种子培养液；（2）发酵培养：将步骤（1）中的种子培养液接种到发酵培养基中，然后加入无菌的氧载体，氧载体的加入量为发酵培养基体积的0.5～10%，发酵得到谷胱甘肽。本发明通过在培养基中加入合适的氧载体，在没有添加其它物质，没有额外能源消耗的条件下，大幅提高了培养基中的溶解氧浓度和细胞膜的通透性；本发明的载体在工艺中不仅起到氧载体的作用，同时提高细胞膜的通透性，可成功实现明显提高表达产物产量的目的，缩短了发酵周期，提高了生产效率。
【专利说明】一种利用氧载体提高酿酒酵母发酵液中谷胱甘肽效价的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及的是一种微生物发酵方法，尤其涉及的是一种利用氧载体提高酿酒酵母发酵液中谷胱甘肽效价的方法。
【背景技术】
[0002]谷胱甘肽(GSH)是一种由L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸组成的三肽化合物，是生物体内一种重要的生理活性物质，特别对维持生物体内氧化还原环境起到十分重要的作用。谷胱甘肽是属于含有巯基的、小分子肽类物质，具有两种重要的抗氧化作用和整合解毒作用。谷胱甘肽分子结构中半胱氨酸上的巯基为其活性基团，故谷胱甘肽常简写为GSH，易与碘乙酸、芥子气(一种毒气)、铅、汞、砷等重金属盐络合，而具有了整合解毒作用。谷胱甘肽(尤其是肝细胞内的谷胱甘肽)具有非常重要的生理作用就是整合解毒作用，能与某些药物(如扑热息痛)、毒素(如自由基、重金属)等结合，参与生物转化作用，从而把机体内有害的毒物转化为无害的物质，排泄出体外。它在临床医药、食品工业、运动营养上的应用不断增加，需求量不断增加。在临床上谷胱甘肽用于治疗和预防肿瘤、肝炎及肝损伤、解毒、辐射病及辐射防护、抗过敏、改善某些疾病的病程和症状、养颜美容护肤、增加视力及眼科疾病和抗衰老等作用。在内分泌调节的治疗中效果明显，并具有改善性功能、消除疲劳及抑制艾滋病病毒的作用。作为抗氧化剂在现代食品加工业中广泛使用，并能增强食品营养价值，改善食品风味。
[0003]谷胱甘肽的另一主要生理作用是作为体内一种重要的抗氧化剂，它能够清除掉人体内的自由基，清洁和净化人体内环境污染，从而增进了人的身心健康。由于还原型谷胱甘肽本身易受某些物质氧化，所以它在体内能够保护许多蛋白质和酶等分子中的巯基不被如自由基等有害物质氧化，从而让蛋白质和酶等分子发挥其生理功能。人体红细胞中谷胱甘肽的含量很多，这对保护红细胞膜上蛋白质的巯基处于还原状态，防止溶血保护红细胞免遭氧化性破坏具有重要意义，而且还可以保护血红蛋白不受过氧化氢氧化、自由基等氧化从而使它持续正常在发挥运输氧的能力。红细胞中部分血红蛋白在过氧化氢等氧化剂的作用下，其中二价铁氧化为三价铁，使血红蛋白转变为高铁血红蛋白，从而失去了带氧能力。还原型谷胱甘肽既能直接与过氧化氢等氧化剂结合，生成水和氧化型谷胱甘肽，也能够将闻铁血红蛋白还原为血红蛋白，提闻体内血红蛋白的含量。
[0004]另外，维生素C也是体内一种重要的抗氧化剂。由于维生素C能可逆地加氢或脱氢，故维生素C在体内许多氧化还原反应中有重要作用。例如，许多酶的活性基团是巯基(-SH)，维生素C能够维持-SH处于还原状态而保持酶的活性；维生素C可以使氧化型谷胱甘肽转变为还原型谷胱甘肽(GSH)，使机体代谢产生的过氧化氢(H2O2)还原；维生素C还可保护维生素A、E及某些B族维生素免受氧化。因此，运用谷胱甘肽时，与维生素C并用，能够提闻其功效。
[0005]GSH对于放射线、放射性药物或由于抗肿瘤药物引起的白细胞减少等症状能起到保护作用。GSH能与进入机体的有毒化合物、重金属离子或致癌物质等相结合，并促其排出体外，起到中和解毒作用。SH还可保护细胞膜，使之免遭氧化性破坏，防止红细胞溶血及促进高铁血红蛋白的还原，对缺氧血症、恶心及肝脏疾病引起的不适具有缓解作用。最新研究还表明，GSH能够纠正乙酰胆碱、胆碱酯酶的不平衡，起到抗过敏作用，还可防止皮肤老化及色素沉着，减少黑色素的形成，改善皮肤抗氧化能力并使皮肤产生光泽，另外，GSH在治疗眼角膜病及改善性功能方面也有很好作用。谷胱甘肽具有的广谱解毒作用，不仅可用于药物，更可作为功能性食品的基料，在延缓衰老、增强免疫力、抗肿瘤等功能性食品广泛应用，随着肽类物质研究的不断深入，肽类物质具有的神奇功能不断发现，对人体的健康事业发挥越来越大的作用。
[0006]第一个谷胱甘肽制备专利发表在1938年，随后各国科学家对它的生产开发进行了大量研究。总的说来生产谷胱甘肽的方法有萃取法、化学合成法、酶转化法和微生物发酵法。萃取法是从含GSH的动植物中提取。由于含量太低此方法没有实际应用价值。化学合成法曾用于早期GSH生产，但工艺复杂，得到的产品为混旋体，分离困难，产品纯度不高。酶转化法目前还处于实验室研究阶段。在目前的4种方法中微生物发酵法最具有潜力。
[0007]微生物发酵法生产GSH在我国研究主要是从上世纪90年代开始的，取得了一些成绩，但国内发酵水平一直停留在2~3g/L，如:中国专CN200710036925.1公开的发酵法合成谷胱甘肽的方法。虽然中国专利CN200810019761.6 一种谷胱甘肽的发酵工艺，也公开了利用经过基因工程改造甲醇利用型酵母生产谷胱甘肽的方法，谷胱甘肽产量可以达到
6.6g/L，但与国际水平7~10g/L (日本协和发酵)还有较大的距离。近年来，利用发酵法生产谷胱甘肽的报道较多，发酵水平也逐渐提高。例如谭天伟等人在Process Biochemistry(2006) 41:2424~2428中利用啤酒酵母高密度发酵，通过在发酵过程中加入前体氨基酸，发酵液中菌体干重达到了 140g/L，谷胱甘肽的浓度达到了 2190mg/L。发酵法生产的谷胱甘肽多存在于微生物的胞内，所以在提高谷胱甘肽含量的同时，产物还原性谷胱甘肽对Y -L-谷氨酰基-L-半胱氨酸合成酶的反馈抑制也在加重，限制了谷胱甘肽产量的进一步提高。另外，发酵过程中的菌体细胞通透性不好，使得加入的底物氨基酸很难进入胞内用于合成谷胱甘肽，导致谷胱甘肽相对于所加入的氨基酸的得率不高，且发酵生产周期长，生产率低，也不利于产物的分离提取。
【发明内容】
[0008]本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种利用氧载体提高酿酒酵母发酵液中谷胱甘肽效价的方法，利用氧载体促进酿酒酵母高密度发酵。
[0009]本发明是通过以下技术方案实现的，本发明包括以下步骤:
[0010](I)种子制备:将酿酒酵母接种到种子培养基中培养得到种子培养液；
[0011](2)发酵培养:将步骤(1)中的种子培养液接种到发酵培养基中，然后加入无菌的氧载体，氧载体的加入量为发酵培养基体积的0.5~10%，发酵得到谷胱甘肽。
[0012]所述步骤(1)中，在种子培养基中加入氧载体，所述氧载体的加入量为种子培养基体积的I~8%。在种子培养基中加入氧载体，一方面提高细胞膜的通透性，另一方面提高供体能量，增加系统整体的供氧能力。
[0013]所述步骤(1)中，酿酒酵母在种子培养基中，30~40°C，150~200rpm恒温培养10~15小时。
[0014]所述步骤(1)中，种子培养基为:酵母提取物5~10g/L、蛋白胨10~20g/L、葡萄糖5~20g/L，pH=7, pH值采用氨水调节。
[0015]所述步骤(2)中，将步骤(1)得到的种子培养液接种到发酵培养基中，30~40°C，200~300rpm，在发酵罐中加入无菌的氧载体，氧载体的加入量为发酵培养基体积的0.5~10%，恒温培养，控制溶解氧30~50%，流加葡萄糖100~500g/L维持菌体生长，待菌体密度达到0D600nm=50以上，加入前体氨基酸L-谷氨酸5~30mmol/L、L_半胱氨酸5~20mmol/L和甘氨酸5~30mmol/L,最终发酵得到谷胱甘肽。
[0016]所述步骤(2)中，发酵培养基为:葡萄糖70g，酵母提取物20g，氯化钙0.2g，磷酸二氢钾5g,硫酸镁IOg,无机离子溶液Iml,水1000ml,pH7,流加用葡萄糖100~500g/L,pH值采用氨水调节。
[0017]所述无机离子溶液的制备方法为:在1000ml蒸馏水中，加入以下物质配制而成=ZnCl20.65 ~0.70g、MnCl2I0.10 ~10.20g、H3BO30.05 ~0.07g、CuCl20.45 ~0.50g、FeCl35.2 ~5.6g,CoCl2Il ~15g、(NH4)6Mo7O24.4Η200.23 ~0.27g、3mol/LH2S0418 ~22ml。
[0018]所述步骤(2)中，氧载体为正十二烷、正己烷或大豆油中的一种或多种的混合物。
[0019]本发明相比现有技术具有以下优点:本发明通过在培养基中加入合适的氧载体，在没有添加其它物质，没有额外能源消耗的条件下，大幅提高了培养基中的溶解氧浓度和细胞膜的通透性，并且不会影响菌种的催化能力，改变了细胞与环境进行物质交换的过程，从而促进酿酒酵母高密度发酵，发酵结束时静置分层回收氧载体循环再利用；本发明的载体在工艺中不仅起到氧载体的作用，同时提高细胞膜的通透性，可成功实现明显提高表达产物产量的目的，缩短了发酵`周期，提高了生产效率。
【具体实施方式】
[0020]下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
[0021]实施例1
[0022]本实施例包括以下步骤:
[0023](I)种子制备:取酿酒酵母接入种子培养基中，在30°C，搅拌速度150~200rpm条件下培养8h，然后转入二代种子培养基中，条件为pH6.5~7，温度30°C培养10~15小时，制备~ 级种子备用；
[0024]种子培养基为:酵母提取物5~10g/L、蛋白胨10~20g/L、葡萄糖5~20g/L，pH=7, pH值采用氨水调节；
[0025]本实施例中酿酒酵母为市面购买而得，所述酿酒酵母由中国工业微生物菌种保藏中心保存，其编号为CICC1898 ；
[0026](2)发酵培养:将得到的种子培养液接种到发酵培养基中，30°C，200~300rpm，在发酵培养基中加入无菌的氧载体正己烷，氧载体的加入量为发酵培养基体积的5%恒温培养，控制溶解氧30~50%，流加葡萄糖100g/L维持菌体生长，pH值用氨水调节至7，菌体密度0D600nm=90，加入前体氨基酸L-谷氨酸20mmol/L、L-半胱氨酸20mmol/L、甘氨酸30mmol/L,最终发酵液中谷胱甘肽3g/L。
[0027]实施例2
[0028]本实施例中，氧载体正十二烷、正己烷和大豆油的混合物，加入量为发酵培养基体积的0.5%，最终发酵液中谷胱甘肽2.lg/L，其他实施方式和实施例1相同。实施例3
[0029]本实施例包括以下步骤:
[0030](I)种子制备:取酿酒酵母接入种子培养基中，在35°C,搅拌速度150~200rpm条件下培养8h，然后转入二代种子培养基中，同时加入无菌的氧载体正十二烷，氧载体的加入量为种子培养基体积的8%，pH=7，温度35°C培养10~15小时，制备二级种子备用；
[0031](2)发酵培养:将得到的种子培养液接种到发酵培养基中，35°C，200~300rpm，在发酵罐中加入无菌的氧载体正十二烷，氧载体的加入量为发酵培养基体积的8%恒温培养，控制溶解氧30~50%，流加葡萄糖500g/L维持菌体生长，pH值用氨水调节至7，菌体密度0D600nm=120,加入前体氨基酸L-谷氨酸20mmol/L、L-半胱氨酸20mmol/L、甘氨酸20mmol/L，最终发酵液中谷胱甘肽6.5g/L。其他实施方式和实施例1相同。
[0032]实施例4
[0033]本实施例中，氧载体为正十二烷和大豆油的混合物，氧载体在步骤(1)的种子培养基内加入量的种子培养基体积的3% ;在步骤(2)的发酵培养基内加入量为发酵培养基体积的10%，制得谷胱甘肽的浓度为7.2g/L。其他实施方式和实施例3相同。
[0034]实施例5
[0035]本实施例中，氧载体为正己烷和大豆油的混合物，氧载体在步骤(1)的种子培养基内加入量的种子培养基体积的1% ;在步骤(2)的发酵培养基内加入量为发酵培养基体积的10%，制得谷胱甘肽的浓度为5.4g/L。其他实施方式和实施例3相同。
[0036]实施例6
[0037]本实施例中，氧载体为大豆油，氧载体在步骤(1)的种子培养基内加入量的种子培养基体积的5% ;在步骤(2)的发酵培养基内加入量为发酵培养基体积的8%，制得谷胱甘肽的浓度为4.5g/L。其他实施方式和实施例3相同。
[0038]实施例7
[0039]本实施例中，没有加入氧载体，其他实施方式和实施例1相同，制得的谷胱甘肽浓度为 1.5g/L。
[0040]由实施例1~7可以看出，加入氧载体后，制得的谷胱甘肽浓度显著提高。
【权利要求】
1.一种利用氧载体提高酿酒酵母发酵液中谷胱甘肽效价的方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)种子制备:将酿酒酵母接种到种子培养基中培养得到种子培养液； (2)发酵培养:将步骤(1)中的种子培养液接种到发酵培养基中,然后加入无菌的氧载体，氧载体的加入量为发酵培养基体积的0.5~10%，发酵得到谷胱甘肽。
2.根据权利要求1所述的一种利用氧载体提高酿酒酵母发酵液中谷胱甘肽效价的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，在种子培养基中加入氧载体，所述氧载体的加入量为种子培养基体积的I~8%。
3.根据权利要求1所述的一种利用氧载体提高酿酒酵母发酵液中谷胱甘肽效价的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，酿酒酵母在种子培养基中，30~40°C，150~200rpm恒温培养10~15小时。
4.根据权利要求1所述的一种利用氧载体提高酿酒酵母发酵液中谷胱甘肽效价的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，种子培养基为:酵母提取物5~10g/L、蛋白胨10~20g/L、葡萄糖5~20g/L, pH=7, pH值采用氨水调节。
5.根据权利要求1所述的一种利用氧载体提高酿酒酵母发酵液中谷胱甘肽效价的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，将步骤(1)得到的种子培养液接种到发酵培养基中，30~40°C, 200~300rpm，在发酵罐中加入无菌的氧载体，氧载体的加入量为发酵培养基体积的0.5~10%，恒温培养，控制溶解氧30~50%，流加葡萄糖100~500g/L维持菌体生长，待菌体密度达到0D600nm=50以上，加入前体氨基酸L-谷氨酸5~30mmol/L、L-半胱氨酸5~20mmol/L和甘氨酸5~30mmol/L,最终发酵得到谷胱甘肽。
6.根据权利要求5所述的一种利用氧载体提高酿酒酵母发酵液中谷胱甘肽效价的方法，其特征在于，所述步 骤(2)中，发酵培养基为:葡萄糖70g，酵母提取物20g，氯化钙0.2g,磷酸二氢钾5g,硫酸镁IOg,无机离子溶液Iml,水1000ml, pH7,流加用葡萄糖100~500g/L，pH值采用氨水调节。
7.根据权利要求6所述的一种利用氧载体提高酿酒酵母发酵液中谷胱甘肽效价的方法，其特征在于，所述无机离子溶液的制备方法为:在1000ml蒸馏水中，加入以下物质配制而成=ZnCl20.65 ~0.70g、MnCl210.10 ~10.20g、H3BO30.05 ~0.07g、CuCl20.45 ~0.50g、FeCl3 5.2 ~5.6g、CoCl2 11 ~15g、(NH4) 6Μο7024.4H20 0.23 ~0.27g、3mol/LH2S04 18 ~22ml ο
8.根据权利要求1或2所述的一种利用氧载体提高酿酒酵母发酵液中谷胱甘肽效价的方法，其特征在于，所述氧载体 为正十二烷、正己烷或大豆油中的一种或多种的混合物。
【文档编号】C12P21/02GK103757076SQ201410012170
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2014年1月10日 优先权日:2014年1月10日
【发明者】邵千飞, 汪德林, 崔秀云, 黄绪民 申请人:安徽立兴化工有限公司