一种革耳菌发酵产漆酶的培养基及产漆酶的方法
【专利摘要】本发明公开了一种革耳菌发酵产漆酶的培养基及产漆酶的方法。所述的培养基配方为：可溶性淀粉10.04g/L、蛋白胨0.2g/L、K2HPO4?0.50g/L、KH2PO4?0.50g/L、ZnSO4·7H2O?0.01g/L、MgSO4·7H2O?0.5g/L、CuSO4·7H2O?0.01g/L、FeSO4·7H2O?0.005g/L、MnSO4?0.05g/L、CaCl2?0.08g/L、VB1?0.1g/L、吐温-40?0.4%，藜芦醇0.05g/L培养基的初始pH=6.8。将发酵种子液接种于该培养基在31℃，转速160r/min下培养产漆酶。本发明提供的用于革耳发酵生产漆酶的培养基，具有产漆酶率高，漆酶活力高等优点，而且培养方法周期短、条件温和。
【专利说明】一种革耳菌发酵产漆酶的培养基及产漆酶的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于真菌培养产漆酶的【技术领域】，具体涉及一株产漆酶的真菌发酵培养基及工艺。更具体的说地，本发明涉及一种革耳发酵产生漆酶的培养基及方法。
【背景技术】
[0002]漆酶(Laccase)是一种含铜的多酚氧化酶，能够氧化多种酚类和芳胺类化合物，并同时将氧分子还原为水。漆酶能够直接作用于木质素，氧化降解酚型木质素结构单元，在某些能够传递电子的小分子介体存在条件下，可以对非酚型的木质素结构单元起到氧化降解的作用。因此漆酶在纸浆生物漂白、工业废水处理、有机染料脱色和高分子催化合成等方面，表现出了很大的研究价值和应用潜力，漆酶被认为是制浆造纸工业中最具有发展前景的酶。
[0003]目前，虽然人们对真菌产酶机制有较多了解，但与实际需要相比，多数试验菌株在人工和天然培养基上生长时合成漆酶产量偏低。且真菌培养时培养周期长，极易被污染，有的需要有毒的芳香类化合物的诱导，产酶活力不稳定且相对都比较低，这就导致漆酶的工业化生产很难实现。因此筛选得到高漆酶的菌株，对于开发漆酶的工业化生产具有很重要的促进作用。
[0004]野生革耳(Panus rudis)是新发现的一种能生产组成型漆酶的白腐真菌，该菌属于担子菌纲(Basidiomycetes)、同担子亚纲(Homobasidiomycetes)、伞菌目(Agaricales)、侧耳科(Pleurotaceae)、革耳属(Panus),同时该菌产生的漆酶具有较好的热稳定性，是一种极具研究价值和开发潜力的真菌漆酶。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种革`耳菌(Panus rudis)FG-35发酵生产漆酶的培养基及方法，该培养基及配套的方法能够高效产漆酶，应用前景广阔。
[0006]—种革耳菌发酵产漆酶的培养基配方:可溶性淀粉5_15g/L、蛋白胨0.2-0.5g/L、K2HPO4 0.5-1.0g/L、KH2PO4 0.5-1.0g/L、ZnSO4 ? 7H20 0.005-0.03g/L、MgSO4 ? 7H200.2-0.5g/L, CuSO4 *7H20 0.01-0.07g/L、FeSO4 ? 7H20 0.005-0.01Og/L,MnSO4 0.005-0.2g/L、CaCl2 0.002-0.4g/L、VBl 0.05-0.4g/L、吐温-40 0.2-1.0%,藜芦醇 0.05-0.5g/L,培养基的 pH=6.8-7.0 ;所述的革耳菌(Panus rudis)FG-35，保藏号为:CCTCC NO:M2013106。
[0007]所述培养基配方优选:可溶性淀粉10.04g/L、蛋白胨0.2g/L、K2HPO4 0.50g/UKH2PO4 0.50g/L、ZnSO4 ? 7H20 0.01g/L、MgSO4 ? 7H20 0.5g/L、CuSO4 ? 7H20 0.01g/L、FeSO4 ? 7H20 0.005g/L、MnSO4 0.07g/L、CaCl2 0.0SgZUVB1 0.lg/L、吐温-40 0.4%，藜芦醇0.05g/L，培养基的 pH=6.8。
[0008]一种革耳菌发酵生产漆酶的方法，包含以下步骤:
[0009](a)将保藏号为CCTCC NO:M2013106的革耳菌(Panus rudis)FG-35接种于种子培养基，制得发酵种子液；[0010](b)将步骤(a)中制得的发酵种子液接种于权利要求1或2所述的培养基中，300mL的三角瓶装液量为50-90mL，接入2 X 106-5 X IO6个菌种孢子，于28-32 °C，转速160-180r/min 下培养 4_6d。
[0011]所述的种子培养基配方:按IL培养基的重量计算，含有15%土豆汁、葡萄糖1%、酒石酸铵0.2%，pH自然；种子在28-32°C、160r/min恒温震荡培养4d得发酵种子液。
[0012]本发明菌株命名为革耳FG-35 (Panus rudis FG-35)，2013年3月26日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为=CCTCC NO:M2013106。
[0013]采用本发明优化后的培养基，菌龄5d，发酵周期6d，发酵产生结果革耳产漆酶为263.31U/mL 以上。
[0014]本发明的有益效果:本发明的发酵周期短；条件温和；提供的用于革耳发酵生产漆酶的培养基，具有产漆酶时间短，漆酶活力高等优点。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1为不同碳源对产漆酶活性的影响；
[0016]图2为不同氮源对产漆酶活性的影响；
[0017]图3为不同无机盐对产漆酶活性的影响；
[0018]图4为不同表面活性剂对产漆酶活性的影响；
[0019]图5为不同诱导物对产漆酶活性的影响；
`[0020]图6为各因素影响效果的排列图；
[0021]图7为可溶性淀粉与CaCl2交互影响酶活力的响应面图及等高线；
[0022]图8为可溶性为淀粉与吐温-40交互影响酶活力的响应面图及等高线；
[0023]图9为CaCl2与吐温-40交互影响酶活力的响应面图及等高线。
【具体实施方式】
[0024]本发明用下列实例来进一步说明本发明，但本发明的保护范围并不仅限于下列实施例。
[0025]实施例1单因素实验确定最优培养基组分
[0026]( I)种子培养基和基础培养基配制
[0027](a)种子培养基:按IL培养基重量计，含15%的土豆汁、葡萄糖1%、酒石酸铵0.2%，pH自然。1.0lMPa,高压蒸汽灭菌20min。
[0028](b)基础培养基:按IL培养基重量计，含15%的土豆汁、葡萄糖1%，酒石酸铵0.2%，pH自然。1.0lMPa,高压蒸汽灭菌20min。
[0029](c)马铃薯琼脂培养基:PDA基础培养基
[0030](2)发酵种子的制作:将革耳菌FG-35 (Panus rudis FG-35，保藏号为:CCTCC NO:M2013106)接种于马铃薯琼脂培养基上，于31°C下培养5d，待其产生孢子，即活化；用接种针将活化后的菌株孢子接种至种子培养基，31°C，转速160r/min下培养96h，即为发酵种子液。
[0031](3)酶液的制备:取步骤(2)下的发酵液在4°C下、4000r/min离心IOmin得上清液即为粗酶液待用。[0032](4)漆酶酶活测定:取100 U L发酵上清液和2.7mL0.lmol/L醋酸缓冲液(pH=4.0)和0.4mL0.5mmol/L2, 2’ -连氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS)溶液，28°C水浴启动反应并连续测定反应前3min内反应液在420nm处吸光度的增加值A 0D42(I。定义该条件下，每分钟催化I U mo I ABTS氧化所需酶量为I个酶活力单位(U)。
【权利要求】
1.一种革耳菌发酵产漆酶的培养基，其特征在于，所述培养基配方:可溶性淀粉 5-15g/L、蛋白胨 0.2-0.5g/L、K2HPO4 0.5-1.0g/L、KH2PO4 0.5-1.0g/L、ZnSO4 ? 7H200.004-0.03g/L、MgSO4 ? 7H20 0.2-0.5g/L、CuSO4 ? 7H20 0.01-0.07g/L、FeSO4 ? 7H200.005-0.010g/L、MnSO4 0.005-0.2g/L、CaCl2 0.002-0.4g/L、VBl 0.05-0.4g/L、吐温-400.2-1.0%,藜芦醇 0.05-0.5g/L,培养基的 pH=6.8-7.0 ;所述的革耳菌(Panus rudis)FG-35，保藏号为:CCTCC NO:M2013106。
2.根据权利要求1所述的革耳菌发酵产漆酶的培养基，其特征在于，所述培养基配方:可溶性淀粉 10.04g/L、蛋白胨0.2g/L、K2HP04 0.50g/L,KH2PO4 0.50g/L,ZnSO4 *7H20 0.01g/UMgSO4.7H20 0.5g/L、CuSO4.7H20 0.01g/L、FeSO4 ? 7H20 0.005g/L、MnSO4 0.07g/L、CaCl20.08g/L、VB1 0.lg/L、吐温-40 0.4%，藜芦醇 0.05g/L，培养基的 pH=6.8。
3.一种革耳菌发酵生产漆酶的方法，其特征在于，包含以下步骤:
Ca)将保藏号为CCTCC NO:M2013106的革耳菌(Panus rudis)FG-35接种于种子培养基，制得发酵种子液； (b)将步骤(a)中制得的发酵种子液接种于权利要求1或2所述的培养基中，300mL的三角瓶装液量为50-90mL，接入2 X 106-5 X IO6个菌种孢子，于28_32°C，转速160_180r/min下培养4-8d。
4.根据权利要求3所述的革耳发酵生产漆酶的方法，其特征在于，所述的种子培养基配方:按IL培养基的重量计算，含有15% 土豆汁、葡萄糖1%、酒石酸铵0.2%，pH自然；种子在28-32°C、160r/min恒温震荡培养4d得发酵种子液。
【文档编号】C12R1/645GK103756980SQ201410012165
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2014年1月10日 优先权日:2014年1月10日
【发明者】周国英, 刘剑, 杨菁, 刘君昂, 李河, 左杰, 田媛媛, 李冬琴, 刘慧娟 申请人:中南林业科技大学