一种利用絮凝作用延长细菌发酵生产丁二酸周期的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及细菌发酵生产下二酸的方法。
【背景技术】
[0002] 下二酸作为最重要的碳四平台化合物，被广泛应用于医药、农药、染料、香料、油 漆、食品和塑料等行业，同时可作为基础原料，合成1，4-下二醇，四氨巧喃，Y -下内醋等有 机化学品W及聚下二酸下二醇醋（PB巧类生物可降解材料，具有巨大的市场潜力。采用生 物法利用细菌发酵将二氧化碳固定，并将糖转化为下二酸的生物技术具有潜在的经济和社 会效益，包括；（0采用生物发酵生产下二酸的代谢路径明确，代谢产物简单，因此结晶产 物下二酸的纯度高，不含有不饱和的二元酸和单酸，因此作为聚合单体质量高，而石化法下 二酸是在一系列催化剂作用下，经氧化、加氨、还原等步骤得到的，因此产品下二酸中会含 有微量的不饱二元酸和单酸，该些杂质对于下二酸与二元醇聚合生产聚醋是不利的。（2)生 物法下二酸生产中每生产It下二酸，将会有0. 37t的CA被菌体利用，有利于减少温室气体 的排放。（3)生物合成下二酸可利用可再生生物质资源，如各种植物枯杆废弃物等作为生产 原料，可利用丰富的农林生物质资源，确保生物基下二酸不受石油价格波动的影响。（4)生 物法制备下二酸可W减少石油、煤等不可再生资源的消耗，达到节能减排的效果，为我国循 环经济的发展和绿色GDP增长作出重要贡献。
[0003] 大肠杆菌由于遗传背景清楚、易操作、易调控、培养基要求简单和生长迅速等优 点，近年来被广泛用于研究W获得产下二酸优秀菌株。
[0004] 重组大肠杆菌在有氧条件下，菌体生长迅速，糖基原料主要通过H駿酸循环被消 耗，并产生能量物质用于菌体细胞大量繁殖；在厌氧发酵条件下，菌体生长缓慢，主要通过 还原H駿酸途径和己酵酸途径积累有机酸。因此，目前利用重组大肠杆菌生长下二酸过程 中采用先有氧培养菌体后厌氧发酵产下二酸的方法。Jiang等人在利用E.coli AFP111两 阶段发酵生产下二酸过程中，厌氧阶段下二酸产物收率>90%，浓度〉lOOg/l，生产速率达到 1.8 ~2. 5g/lii (Applied and Elnvironmental Microbiology. 2010, 76 (4): 1298-1300)， 但若考虑有氧阶段菌体培养的时间和消耗的碳源，下二酸的的收率、浓度和生产速率均大 幅下降。因此采用合适的方法回收细胞将可有效降低下二酸的菌种成本，从而使总的生产 成本得到有效控制。Ma等人在在利用E.coli AFP111两阶段发酵生产了二酸过程中，在两 阶段发酵结束时通过离也的方法回收细胞并再次转入新鲜培养基中厌氧发酵合成下二酸 (Biotechnology Letter. 2010, 32 (10) : 1413-1418)。但是离也过程细胞回收率一般只能在 80%左右，而且离也过程的能耗相对较高，因此采用一种温和、高效的细胞回收策略是重组 大肠杆菌两阶段发酵产下二酸过程需要解决的关键问题之一。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是在生产下二酸重组大肠杆菌两阶段发酵结束时，通过 一种温和、高效的方法回收菌体细胞，并最终能够转入新鲜培养基中再次转化合成下二酸。
[0006] 为实现本发明的技术目的，本发明采用W下技术方案：
[0007] -种利用絮凝作用延长细菌发酵生产下二酸周期的方法，其包括下列步骤：
[0008] (1)菌种活化；从甘油冻存管中取少量菌液，在LB平板上划线后放置于37C下培 养 12h ;
[0009] (2)种子液制备；从LB平板上取单菌落，接种于LB液体培养基，在37°C，200r/min 条件下摇瓶培养6~她，至菌体密度（ODe。。）值在0. 6~0. 8之间；
[0010] (3)发酵产下二酸过程；按3~10%的接种量接种发酵培养基，先同空气有氧培养 至菌体密度（ODe。。）值在30~40之间，再W 0. 1~0. 2vvm的通气流量连续通二氧化碳气 体维持发酵罐中厌氧环境，并W碳酸轴作为酸中和剂控制抑值在6. 4~7. 2,控制温度在 35 ~40〇C ;
[0011] (4)在一次厌氧发酵结束时，培养基中一次性添加絮凝剂，其使用总量在0. 25~ 0. 75g/L之间，然后停止发酵罐的揽拌，使发酵液静置5~10分钟后，用粟从预先插入发酵 罐四分之H液位处的管子将发酵液抽出四分之H发酵液，发酵液中的细胞此时绝大多数沉 在发酵罐的底部，随后补入相同体积的新鲜培养基，开启揽拌继续发酵。如此循环3~5次。
[0012] 上述的延长细菌发酵生产下二酸周期的方法，步骤（1)所述的菌种是产下二酸重 组大肠杆菌。
[0013] 上述的延长细菌发酵生产下二酸周期的方法，生产下二酸发酵菌是大肠埃希氏菌 BA308。它的中国典型培养物保藏中也的保存编号为CCTCCN〇:M2013159,并已申请专利，专 利申请号为201310288669. 0。
[0014] 上述的延长细菌发酵生产下二酸周期的方法，步骤（4)所述的絮凝剂是海藻酸轴、 壳聚糖或聚己帰亚胺中的一种或者多种混合物。
[0015] 技术效果
[0016] 本发明的有益效果在于产下二酸重组大肠杆菌在两阶段发酵结束后可W采用添 加絮凝剂的方法回收菌体细胞，并且絮凝的细胞仍然具有活性，可W再次转入新鲜培养基 中厌氧发酵生产下二酸，有效延迟了有氧培养获得的细胞的总的产酸周期。
【附图说明】
[0017] 图1为海藻酸轴作为絮凝剂其添加量对絮凝效果的影响。
[0018] 图2为壳聚糖作为絮凝剂其添加量对絮凝效果的影响。
[0019] 图3为聚己帰亚胺作为絮凝剂其添加量对絮凝效果的影响。
【具体实施方式】
[0020] 下面对本发明的【具体实施方式】进行详细说明，但是需要指出的是，本发明的保护 范围并不受该些【具体实施方式】的限制，而是由权利要求书来确定。
[00川 实施例1
[0022] 菌种活化与培养方法如下；（1)菌种活化：从甘油冻存管中取少量大肠埃希氏菌 BA308菌液，在LB平板上划线后放置于37C下培养12h ; (2)种子液制备；从LB平板上取单 菌落，接种于LB液体培养基，在37C，200r/min条件下摇瓶培养6~她，至菌体密度（ODe。。） 值在0. 6~0. 8之间；（3)发酵产下二酸过程；按3~10%的接种量接种发酵培养基，先同 空气有氧培养至菌体密度（ODe。。)值在30~40之间，再w 0. 1~0. 2vvm的通气流量连续通 二氧化碳气体维持发酵罐中厌氧环境，并W碳酸轴作为酸中和剂控制抑值在6. 4~7. 2。 考虑到厌氧发酵结束时，抑在6. 4,因此絮凝过程都在抑6. 4条件下进行。当海藻酸轴作 为絮凝剂时，其添加量对絮凝效果的影响如图1所示。由图可知，过多或者过少的絮凝剂均 会使絮凝效率有所下降，因此单独添加海藻酸轴时，0. 5g/L的用量是最佳的，其絮凝率可达 97〇/〇。
[002引 实施例2
[0024] 菌种活化与培养方法同上。考虑到厌氧发酵结束时，抑在6. 4,因此絮凝过程都在 P册.4条件下进行。当壳聚糖作为絮凝剂时，其添加量对絮凝效果的影响如图2所示。由图 可知，过多或者过少的絮凝剂均会使絮凝效率有所下降，因此单独添加壳聚糖时，0. 625g/L 的用量是最佳的，其絮凝率可达95%。
[00幼 实施例3
[0026] 菌种活化与培养方法同上。当聚己帰亚胺作为絮凝剂时，其添加量对絮凝效果的 影响如图3所示。由图可知，过多或者过少的絮凝剂均会使絮凝效率有所下降，因此单独添 加聚己帰亚胺时，0. 25g/L的用量是最佳的，其絮凝率可达98%。
[0027] 实施例4
[0028] 菌种活化与培养方法同上。考虑到絮凝剂的使用弹性，考察了分别添加不同絮凝 剂对絮凝效率，同时将絮凝后菌种细胞进行沉降收集再次用于发酵产下二酸，结果见表1。 由表中结果可知，单独或者配伍使用该H种絮凝剂具有较好的絮凝效果，且絮凝细胞仍然 具有厌氧发酵生产下二酸的能力。
[0029] 表1絮凝剂的絮凝效果
[0030]
【主权项】
1. 一种利用絮凝作用延长细菌发酵生产丁二酸周期的方法，其特征是包括下列步骤： (1)菌种活化：从甘油冻存管中取少量菌液，在LB平板上划线后放置于37°C下培养12h ; (2) 种子液制备：从LB平板上取单菌落，接种于LB液体培养基，在37°C，200r/min条 件下摇瓶培养6~8h，至菌体密度（OD 6tltl)值在0. 6~0. 8之间； (3) 发酵产丁二酸过程：按3~10%的接种量接种发酵培养基，先同空气有氧培养至菌 体密度（OD6tltl)值在30~40之间，再以0. 1~0. 2vvm的通气流量连续通二氧化碳气体维 持发酵罐中厌氧环境，并以碳酸钠作为酸中和剂控制pH值在6. 4~7. 2,控制温度在35~ 40 0C ； (4) 在一次厌氧发酵结束时，培养基中一次性添加絮凝剂，其使用总量在0. 25~ 〇. 75g/L之间，然后停止发酵罐的搅拌，使发酵液静置5~10分钟后，用泵从预先插入发酵 罐四分之三液位处的管子将发酵液抽出四分之三发酵液，发酵液中的细胞此时绝大多数沉 在发酵罐的底部，随后补入相同体积的新鲜培养基，开启搅拌继续发酵。
2. 根据权利要求1所述的延长细菌发酵生产丁二酸周期的方法，其特征是：步骤（1)所 述的菌种是产丁二酸重组大肠杆菌。
3. 根据权利要求2所述的延长细菌发酵生产丁二酸周期的方法，其特征是：产丁二酸 重组大肠杆菌是大肠埃希氏菌BA308。
4. 根据权利要求1所述的延长细菌发酵生产丁二酸周期的方法，其特征是：步骤（4)所 述的絮凝剂是海藻酸钠、壳聚糖或聚乙烯亚胺中的一种或者多种混合物。
5. 根据权利要求1所述的延长细菌发酵生产丁二酸周期的方法，其特征是：所述的絮 凝的细胞能重复循环发酵3~5次。
【专利摘要】一种利用絮凝作用延长细菌发酵生产丁二酸周期的方法，它是：在一次厌氧发酵结束时，培养基中一次性添加海藻酸钠、壳聚糖或聚乙烯亚胺中的一种或者多种，其使用总量在0.25～0.75g/L之间，絮凝回收菌体细胞，并且絮凝的细胞仍然具有活性，可以再次转入新鲜培养基中厌氧发酵生产丁二酸，有效延迟了有氧培养获得的细胞的总的产酸周期。
【IPC分类】C12R1-19, C12P7-46
【公开号】CN104630290
【申请号】CN201310559935
【发明人】马江锋, 方晓江, 刘经伟, 李泽壮, 刘丽娟, 王英武, 陈韶辉, 杨爱武
【申请人】中国石油化工股份有限公司, 中国石化扬子石油化工有限公司
【公开日】2015年5月20日
【申请日】2013年11月12日