专利名称：类球红细菌工业化规模制备方法及其发酵液与用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种利用细菌发酵制成一种功能性发酵液的生产方法，特别是利用类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)制成一种功能性发酵液的生产方法。
背景技术：
目前，对于类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)的研究仅限于实验室水平，没有利用类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)的技术方案进行工业规模的深层发酵方法。同时，在饮料行业中，缺少一种利用生物发酵技术坐产的能对人体的健康起到极大促进作用的饮料。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用对类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)进行深层的工业化规模的发酵方法，得到的发酵液对人体的健康有益，能对人体的免疫系统进行调节，增加人体抵抗力。
在本发明人的系列专利(中国CN1184307C)中，涉及了类似的发酵方法，但是经过发明人几年的继续试验，优化了发酵培养液的成分，并且优化了发酵条件，得到了效果更好、成本更低的发酵液。
本发明利用类球红细菌工业化规模发酵的方法，该方法是将类球红细菌(Rhodobactersphaeroides)依次经过500ml三角烧瓶、50-200L的一级种子罐、500-2000L的二级种子罐和5000-20000L大型发酵罐深层发酵，发酵条件分别为500ml三角烧瓶恒温25-35℃，用300LX白炽灯光照，摇床转速每分钟50-60转下进行24小时；200L种子罐pH6.4-7.5，温度为25-35℃，用300LX白炽灯通过两个不同角度的视镜光照，恒温25-35℃发酵24小时通过一级种子罐(50-200L)与二级种子罐(500-2000L)进行扩大培养24小时，其中的培养温度、pH值、光照和通气压力与一级种子罐相同；
一级和二级种子罐的压力都为0.04Mpa；大型发酵罐的发酵条件如下通过三个不同角度的视镜给300-500LX炽灯光的光照，料液pH6.4-7.5，进气压力0.1-0.3Mpa，调整罐内压力0.05-0.08Mpa，控制温度25-35℃，发酵24小时；即得到发酵液，其特征在于所述的类球红细菌为保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心、编号CGMCC No.1562，所述的培养液的配制方法为1000ml蒸馏水中无机盐溶液配比；MgSO4·7H2O 0.2-3.0克CaCl·2H2O0.1-1.0克FeSO4·7H2O 0.1-1.0克NaEDTA0.1-1.0克250ml蒸馏水中微量元素溶液配比；H3BO40.5-1.5克MnSO450-200毫克NaMoO420-100毫克ZnSO410-20毫克Cu(NO3)22-3毫克钼酸钠 6-15毫克亚硒酸钠6-15毫克；100ml蒸馏水中生长因子溶液配比生物素 0.2-0.5毫克维生素B110-30毫克烟酸10-30毫克对氨基苯甲酸10-20毫克；乳酸溶液配比蒸馏水 900毫升乳酸30-100毫升，用12N的NaOH溶液调pH6.4；硫酸铵溶液配比蒸馏水 800毫升硫酸铵3-8克用水加至1000毫升；溶解后用蒸馏水添至1000毫升，然后用12N的NaOH溶液调pH6.4磷酸缓冲液K2HPO415-50克KH2PO410-15克用水加至1000毫升；分别取a、无机盐溶液 10-30％、b、微量元素溶液0.1-1.0％c、生长因子溶液0.1％d、乳酸溶液2-10％e、硫酸铵溶液 0.5-2％f、磷酸缓冲液 1-5％将配比a-f按照上述百分比进行混合，其余为水，即得到培养液。做斜面试管或培养皿培养基时候另外添加蛋白胨1％，酵母膏0.2％。
优选1000ml蒸馏水中无机盐溶液配比；MgSO4·7H2O 0.3克CaCl·2H2O0.05克FeSO4·7H2O 0.5克NaEDTA0.5克250ml蒸馏水中微量元素溶液配比；H3BO41.0克MnSO4120毫克NaMoO460毫克ZnSO415毫克Cu(NO3)22毫克钼酸钠 12毫克亚硒酸钠12毫克；100ml蒸馏水中生长因子溶液配比生物素 0.5毫克维生素B110毫克烟酸10毫克对氨基苯甲酸10毫克；乳酸溶液配比蒸馏水 900毫升乳酸40毫升，用12N的NaOH溶液调pH6.4；硫酸铵溶液配比蒸馏水800毫升硫酸铵5克用水加至1000毫升；溶解后用蒸馏水添至1000毫升，然后用12N的NaOH溶液调pH6.4磷酸缓冲液K2HPO440克KH2PO410克用水加至1000毫升；分别取a、无机盐溶液 20％、b、微量元素溶液0.2％c、生长因子溶液0.1％d、乳酸溶液5％e、硫酸铵溶液 1.5％f、磷酸缓冲液 3％将配比a-f按照上述百分比进行混合，其余为水，即得到培养液。做斜面试管或培养皿培养基时候另外添加蛋白胨1％，酵母膏0.2％。
用上述方法得到的发酵液具有如下用途用其制备生物饮料，其中将发酵液与纯净水混合后，加食品添加剂调整口味。
用5-10倍发酵液灌溉根部腐烂处可以治疗根腐病。
用50-100倍的权利要求3中所述的发酵液喷洒水果果实和可生食蔬菜，可使植物果实的SOD提高。
用100-150倍的权利要求3中所述的发酵液作为活菌生物材料。
给养鱼、虾或蟹的池塘中按池塘水量的3-5ppm添加，会净化水质、减少疾病、提高生长速度。
发酵液与水按照1∶5-10倍添加到奶牛、猪、鸡的饲料或者饮用水中喂养。
以上的发酵液使用的频率和剂量为，1-3次每天，使用期限1个月以上效果明显。
有益效果缩短了发酵时间，生产成本低，使用效果好，在实际的应用中得到了非常好的效果。
具体应用和检测结果如下检测单位中国科学院微生物研究所；(2004)微检字第095号 检测鉴定负责人周宇光发现了植物所需要的多种营养成分，包括了多种植物生长所必需的成分，还检测了本发明产品与42种常用药的敏感性测试。
检测单位山东省烟台市农业科学研究所；试验完成人姜学玲名称植物生长菌剂在黄瓜上试验总结报告结果经过对照组试验得到第一组亩产纯收入增加766.5元至995.25元第二组亩产纯收入增加566.5元至916.8元(经过亩产量和当年的标准市价得到)投入产出比分别为1∶2.83，1∶8.48，1∶61.12。
不同施用方法黄瓜增产幅达到10％以上。
施用方法为地下冲施结合叶面喷施或者单独叶面喷施。发酵液100倍稀释。
检测单位山东省烟台市农业科学研究所；试验完成人姜学玲名称植物生长菌剂在辣椒上试验总结报告结果经过对照组试验得到
增产率达到5-10.7％投入产出比分别为1∶3.1，1∶2.9，1∶29.5。
投入1元钱发酵液，可以得到2.9元回报，叶面喷施可以得到29.5元回报。
施用方法为地下冲施结合叶面喷施或者单独叶面喷施。发酵液100倍稀释，进行叶面喷施，保证连续3次以上。
检测单位滨州市土壤肥料工作站；试验完成人孙福来名称植物生长菌剂在黄瓜上试验总结报告时间2005.4.16至2005.7.25结果经过对照组试验得到亩产纯收入增加436.24元至754.565元(经过亩产量和当年的标准市价得到)投入产出比分别为1∶2.18，1∶6.76，1∶50.3。
不同施用方法黄瓜增产幅达到10％以上。
施用方法为地下冲施结合叶面喷施或者单独叶面喷施。发酵液100倍稀释。
检测单位滨州市土壤肥料工作站；试验完成人孙福来名称植物生长菌剂在辣椒上试验总结报告时间2005.4.16至2005.7.31结果经过对照组试验得到投入产出比分别为1∶2.9，1∶2.6，1∶25.8。
不同施用方法辣椒增产幅达到5％以上。
检测对人、畜无公害。
施用方法为地下冲施结合叶面喷施或者单独叶面喷施。发酵液100倍稀释。
检验报告(山东省农业科学院中心实验室)对以下三种农药具有降解的作用敌敌畏、高效氯氰菊酯、甲胺磷乳油、毒死蜱，效果非常明显。
菌种来源山东省蓬莱市村里集镇宋家河上段淤泥中。
菌种保藏号中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC No.1562。
保藏时间2005年12月12日。
分离方法于7-8月取河中淤泥1升，用按照上述方法配制的培养液10升分别装入22个500ml三角烧瓶中，用纱布包棉塞塞好瓶中，外用旧报纸包好，用纸绳扎紧，置于高温灭菌锅内加热至121℃进行30分钟灭菌后，降至35℃。将淤泥在无菌室内边搅拌慢慢地分别平均地分入22瓶培养液。然后用10％乳酸溶液调节pH6.4-7.5，用原瓶上的棉塞塞好，包好报纸用纸绳扎紧，置于25-35℃恒温摇床上，摇床转速每分钟50-60转摇动，同时给白炽灯光照，光照要求每平方米100LX即可。摇床培养40小时后，取有红色反应的培养液(取上层液)，在接种室内用移液管移入培养皿(按照上述的培养基配方配制)，置于上述培养条件下培养一周，然后再从培养皿中在无菌室内取红点较大的菌落接入上述相同的培养液中，进入扶壮培养，这样反复进行数十次分离培养、扶壮，取样镜检，达到无杂菌的纯种并能在24小时的发酵指数达到50亿个/毫升以上，用分光光度计设定在波长525-530nm处测定吸光值为1.50，可为生产用种。
生产方法将试管或培养皿菌种在无菌室内接入500ml三角烧瓶的培养液中(三角烧瓶中的培养基配方同上，消毒及温度和pH值同上)，放置摇床上恒温25-35℃，用300LX白炽灯光照，摇床转速每分钟50-60转下进行24小时，抽样检测50亿个/毫升以上时用消毒后的接种器接入50-200L种子罐，接种量应大于10％，种子罐的培养液配方同上，培养液配制完成后测pH6.4-7.5为宜，调pH用乳酸溶液或12N的NaOH溶液，消毒温度121℃进行30分钟。然后往罐体夹套通冷水降温至35℃时接种，接种完成后通进过滤除菌后的压缩空气从罐的底部进入进行搅拌，罐内的温度为25-35℃，进气压力0.1-0.3Mpa，罐内压力0.03-0.08Mpa左右为宜。同样用白炽灯通过两个不同角度的视镜光照300LX。罐内压力的调整从罐顶部的放气阀控制。恒温25-35℃发酵24小时后，再按上述方法通过一级种子罐(200L)与二级种于罐(2000L)的连接管道转接至二级种子罐(二级种子罐的培养液与一级种子罐相同)进行扩大培养24小时，其中的培养温度、pH值、光照和通气压力与一级种子罐相同，在二级种子罐发酵培养完成后，用同样的方式转接至10000L大型发酵罐中进行规模化发酵。大型发酵罐内的基料配方与前述相同，只是把所用的蒸馏水改成膜过滤净水，转入大型发酵罐的条件如下通过三个不同角度的视镜给白炽灯光1000LX的光照，料液pH6.4-7.5，进气压力0.3Mpa，调整罐内压力0.05-0.08Mpa，控制温度35℃，发酵24小时，每2小时取样检测，发酵中发现染菌时立即停止发酵，发酵的成品菌液为40-50亿个/毫升。得到的发酵液即为农业用和水产养殖及家禽家畜用，本发明的功能性口服液。
实施例1发酵液培养液的配制方法1000ml蒸馏水中无机盐溶液配比；MgSO4·7H2O 0.3克CaCl·2H2O0.05克FeSO4·7H2O 0.5克NaEDTA0.5克250ml蒸馏水中微量元素溶液配比；H3BO41.0克MnSO4120毫克NaMoO460毫克ZnSO415毫克Cu(NO3)22毫克钼酸钠 12毫克亚硒酸钠 12毫克；100ml蒸馏水中生长因子溶液配比生物素0.5毫克维生素B110毫克烟酸 10毫克对氨基苯甲酸 10毫克；乳酸溶液配比蒸馏水900毫升乳酸 40毫升，用12N的NaOH溶液调pH6.4；硫酸铵溶液配比蒸馏水800毫升硫酸铵5克用水加至1000毫升；溶解后用蒸馏水添至1000毫升，然后用12N的NaOH溶液调pH6.4磷酸缓冲液K2HPO440克KH2PO410克用水加至1000毫升；分别取a、无机盐溶液 20％、b、微量元素溶液0.2％c、生长因子溶液0.1％d、乳酸溶液5％e、硫酸铵溶液 1.5％f、磷酸缓冲液 3％将配比a-f按照上述百分比进行混合，其余为水，即得到培养液。
做斜面试管或培养皿培养基时候另外添加蛋白胨1％，酵母膏0.2％。
实施例21000ml蒸馏水中无机盐溶液配比；MgSO4·7H2O 3.0克CaCl·2H2O 1.0克FeSO4·7H2O 1.0克NaEDTA 1.0克250ml蒸馏水中微量元素溶液配比；H3BO41.5克MnSO4200毫克
NaMoO4100毫克ZnSO420毫克Cu(NO3)23毫克钼酸钠 15毫克亚硒酸钠15毫克；100ml蒸馏水中生长因子溶液配比生物素 0.5毫克维生素B130毫克烟酸30毫克对氨基苯甲酸20毫克；乳酸溶液配比蒸馏水900毫升乳酸 100毫升，用12N的NaOH溶液调pH6.4；硫酸铵溶液配比蒸馏水800毫升硫酸铵8克用水加至1000毫升；溶解后用蒸馏水添至1000毫升，然后用12N的NaOH溶液调pH6.4磷酸缓冲液K2HPO450克KH2PO415克用水加至1000毫升；分别取a、无机盐溶液 30％、b、微量元素溶液1.0％c、生长因子溶液0.1％d、乳酸溶液10％e、硫酸铵溶液 2％f、磷酸缓冲液 5％
将配比a-f按照上述百分比进行混合，其余为水，即得到培养液。
做斜面试管或培养皿培养基时候另外添加蛋白胨1％，酵母膏0.2％。
实施例31000ml蒸馏水中无机盐溶液配比；MgSO4·7H2O 0.2克CaCl·2H2O0.1克FeSO4·7H2O 0.1克NaEDTA0.1克250ml蒸馏水中微量元素溶液配比；H3BO40.5克MnSO450毫克NaMoO420毫克ZnSO410毫克Cu(NO3)22毫克钼酸钠 6毫克亚硒酸钠 6毫克；100ml蒸馏水中生长因子溶液配比生物素 0.2毫克维生素B110毫克烟酸10毫克对氨基苯甲酸10毫克；乳酸溶液配比蒸馏水900毫升乳酸 30毫升，用12N的NaOH溶液调pH6.4；硫酸铵溶液配比蒸馏水800毫升硫酸铵3克用水加至1000毫升；
溶解后用蒸馏水添至1000毫升，然后用12N的NaOH溶液调pH6.4磷酸缓冲液K2HPO415克KH2PO410克用水加至1000毫升；分别取a、无机盐溶液 10％、b、微量元素溶液0.1％c、生长因子溶液0.1％d、乳酸溶液2％e、硫酸铵溶液 0.5％f、磷酸缓冲液 1％将配比a-f按照上述百分比进行混合，其余为水，即得到培养液。
做斜面试管或培养皿培养基时候另外添加蛋白胨1％，酵母膏0.2％。
实施例41000ml蒸馏水中无机盐溶液配比；MgSO4·7H2O 3.0克CaCl·2H2O 0.1克FeSO4·7H2O 1.0克NaEDTA 1.0克250ml蒸馏水中微量元素溶液配比；H3BO40.5克MnSO4200毫克NaMoO420毫克ZnSO410毫克Cu(NO3)23毫克钼酸钠 15毫克亚硒酸钠6毫克；
100ml蒸馏水中生长因子溶液配比生物素 0.2毫克维生素B130毫克烟酸30毫克对氨基苯甲酸10毫克；乳酸溶液配比蒸馏水900毫升乳酸 500毫升，用12N的NaOH溶液调pH6.4；硫酸铵溶液配比蒸馏水800毫升硫酸铵5克用水加至1000毫升；溶解后用蒸馏水添至1000毫升，然后用12N的NaOH溶液调pH6.4磷酸缓冲液K2HPO430克KH2PO412克用水加至1000毫升；分别取a、无机盐溶液 15％、b、微量元素溶液0.5％c、生长因子溶液0.1％d、乳酸溶液5％e、硫酸铵溶液 1.5％f、磷酸缓冲液 3％将配比a-f按照上述百分比进行混合，其余为水，即得到培养液。
做斜面试管或培养皿培养基时候另外添加蛋白胨1％，酵母膏0.2％。
发酵液的应用1、用发酵液配以3％的槐花蜂蜜即可做成免疫调节，养护肠道功能的口服液。
2、莲子草提取液接二级种子发酵完成的发酵液即为调节血糖的降糖液。
3、用发酵液与纯净水加食品添加剂调整口味即为生物饮料。
4、用发酵液直接用于无公害蔬菜、水果等植物营养液，可生产SOD蔬菜和水果。
5、苹果树、樱桃树、杏树、梨树等果树的根腐病，用5-10倍发酵液灌溉根部腐烂处可以治疗根腐病。
6、应用发酵液与水按照1∶5-10倍添加到奶牛、猪、鸡的饲料或者饮用水中喂养，可使奶牛提高产奶率10-20％，使家禽家畜提高免疫力、减少疾病、加快生长。
7、给养鱼、虾、蟹等水产品的池塘中按池塘水量的3-5ppm添加，会净化水质、减少疾病、提高生长速度。
用本发明发酵液所生产的产品具有对人体无副作用，能够对生物免疫系统起到调节的作用，对人体健康极为有利。
权利要求
1.一种利用类球红细菌工业化规模发酵的方法，其特征在于该方法是将类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)依次经过500ml三角烧瓶、50-200L的一级种子罐、500-2000L的二级种子罐和5000-20000L大型发酵罐深层发酵，发酵条件分别为500ml三角烧瓶恒温25-35℃，用300LX白炽灯光照，摇床转速每分钟50-60转下进行24小时；200L种子罐pH6.4-7.5，温度为25-35℃，用300LX白炽灯通过两个不同角度的视镜光照，恒温25-35℃发酵24小时通过一级种子罐(50-200L)与二级种子罐(500-2000L)进行扩大培养24小时，其中的培养温度、pH值、光照和通气压力与一级种子罐相同；一级和二级种子罐的压力都为0.04Mpa；大型发酵罐的发酵条件如下通过三个不同角度的视镜给300-500LX白炽灯光的光照，料液pH6.4-7.5，进气压力0.1-0.3Mpa，调整罐内压力0.05-0.08Mpa，控制温度25-35℃，发酵24小时；即得到发酵液，其特征在于所述的类球红细菌为保臧于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心、编号CGMCC No.1562，所述的培养液的配制方法为1000ml蒸馏水中无机盐溶液配比；MgSO4·7H2O 0.2-3.0克CaCl·2H2O0.1-1.0克FeSO4·7H2O 0.1-1.0克NaEDTA0.1-1.0克250ml蒸馏水中微量元素溶液配比；H3BO40.5-1.5克MnSO450-200毫克NaMoO420-100毫克ZnSO410-20毫克Cu(NO3)22-3毫克钼酸钠6-15毫克亚硒酸钠 6-15毫克；100ml蒸馏水中生长因子溶液配比生物素0.2-0.5毫克维生素B110-30毫克烟酸 10-30毫克对氨基苯甲酸 10-20毫克；乳酸溶液配比蒸馏水900毫升乳酸 30-100毫升，用12N的NaOH溶液调pH6.4；硫酸铵溶液配比蒸馏水800毫升硫酸铵3-8克用水加至1000毫升；溶解后用蒸馏水添至1000毫升，然后用12N的NaOH溶液调pH6.4磷酸缓冲液K2HPO415-50克KH2PO410-15克用水加至1000毫升；分别取a、无机盐溶液 10-30％、b、微量元素溶液0.1-1.0％c、生长因子溶液0.1％d、乳酸溶液2-10％e、硫酸铵溶液 0.5-2％f、磷酸缓冲液 1-5％将配比a-f按照上述百分比进行混合，其余为水，即得到培养液。做斜面试管或培养皿培养基时候另外添加蛋白胨1％，酵母膏0.2％。
2.如权利要求1所述利用类球红细菌工业化规模发酵的方法，其特征在于其中1000ml蒸馏水中无机盐溶液配比；MgSO4·7H2O 0.3克CaCl·2H2O0.05克FeSO4·7H2O 0.5克NaEDTA0.5克250ml蒸馏水中微量元素溶液配比；H3BO41.0克MnSO4120毫克NaMoO460毫克ZnSO415毫克Cu(NO3)22毫克钼酸钠12毫克亚硒酸钠 12毫克；100ml蒸馏水中生长因子溶液配比生物素0.5毫克维生素B110毫克烟酸 10毫克对氨基苯甲酸 10毫克；乳酸溶液配比蒸馏水900毫升乳酸 40毫升，用12N的NaOH溶液调pH6.4；硫酸铵溶液配比蒸馏水800毫升硫酸铵5克用水加至1000毫升；溶解后用蒸馏水添至1000毫升，然后用12N的NaOH溶液调pH6.4磷酸缓冲液K2HPO440克KH2PO410克用水加至1000毫升；分别取a、无机盐溶液 20％、b、微量元素溶液0.2％c、生长因子溶液0.1％d、乳酸溶液5％e、硫酸铵溶液 1.5％f、磷酸缓冲液 3％将配比a-f按照上述百分比进行混合，其余为水，即得到培养液。做斜面试管或培养皿培养基时候另外添加蛋白胨1％，酵母膏0.2％。
3.一种发酵液，其特征在于利用权利要求1中所述的利用类球红细菌工业化规模发酵的方法来生产。
4.如权利要求3中所述发酵液的用途，其特征在于用其制备生物饮料，其中将发酵液与纯净水混合后，加食品添加剂调整口味。
5.如权利要求3中所述发酵液的用途，其特征在于用5-10倍发酵液灌溉根部腐烂处可以治疗根腐病。
6.如权利要求3中所述发酵液的用途，其特征在于用50-100倍的权利要求3中所述的发酵液喷洒水果果实和可生食蔬菜，可使植物果实的SOD提高。
7.如权利要求3中所述发酵液的用途，其特征在于用100-150倍的权利要求3中所述的发酵液作为活菌生物材料。
8.如权利要求3中所述发酵液的用途，其特征在于给养鱼、虾或蟹的池塘中按池塘水量的3-5ppm添加，会净化水质、减少疾病、提高生长速度。
9.如权利要求3中所述发酵液的用途，其特征在于发酵液与水按照1∶5-10倍添加到奶牛、猪、鸡的饲料或者饮用水中喂养。
全文摘要
本发明公开了一种利用细菌发酵制成一种多功能性发酵液的生产方法，特别是利用类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)制成一种功能性发酵液的生产方法。该菌种的保藏号为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC No.1562。保藏时间2005年12月12日。方法是将培养皿分离后进行了摇瓶扶壮的菌种进行一级种子罐(200L)与二级种子罐(2000L)的扩大培养，用同样的方式转接至5000L至20000L大型发酵罐中进行规模化发酵。
文档编号C02F3/34GK1986774SQ20051013262
公开日2007年6月27日 申请日期2005年12月23日 优先权日2005年12月23日
发明者王栋 申请人:王栋