一种乳酸菌细菌素工业生产发酵培养基及发酵条件的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一株乳酸片球菌PA003 (Pediococcus acidilactici PA003)筛选得到 的工业培养基配方及高密度发酵生产乳酸片球菌素的条件。
【背景技术】
[0002] 食品受病原微生物污染后引起食源性疾病，受腐败微生物的污染会发生不同程 度的腐败变质，世界范围内，微生物的污染是导致食品安全性下降的主要原因。杀灭或抑制 食品中微生物的方法很多，包括食品的冷藏、高温处理、腌制、发酵、干制、真空包装、电离辐 射等。此外，为防止食品腐败，向食品中加入化学防腐剂是很常见的做法。但许多方法都有 其应用的局限性，如长期大量使用化学防腐剂以后一些微生物对其产生耐药性，有的防腐 剂还对人体有毒副作用。
[0003] 在控制食品中病原性和腐败性微生物方面，一个重要的发展就是细菌素的发现。 细菌素为肽类物质，由细菌产生，在食品工业上，细菌素指的是由乳酸菌产生，对许多腐 败和病原细菌有杀灭作用。因为他们符合公认安全的标准（Generallyrecognizedas safe，GRAS)，因此，具有作为食品保藏剂的巨大潜力。乳酸菌产生的细菌素对食品工业有极 强的吸引力，还因为他们属于天然食品防腐剂，使用这些抗菌肽可以大大减少化学添加剂 的使用量或减少物理处理的强度。
[0004] 到目前为止，nisin(乳链球菌素）是唯一得到商业化和大规模应用的细菌素。WHO1961年允许在食品中使用该细菌素，现在，全世界大约有50个国家认为它是安全的，允许 作为食品添加剂。尽管nisin具有抗菌谱较广、天然、无毒副作用、安全、高效等优点，但其 在在中性和碱性条件下溶解度低，对食品中一些酶敏感，及一些细菌可对其产生抗性等问 题。因此，对于仅单独用一种细菌素贮藏的食品，抗细菌素的病原微生物的出现是潜在的威 胁。
[0005] 克服这些问题的途径之一是开发更多的细菌素，并将多种细菌素联合应用，以弥 补使用单一细菌素可能出现的问题。Nisin在食品中的成功应用刺激了从乳酸菌中发现新 细菌素的研宄。迄今为止，又发现了许多新的细菌素，其中研宄最早和最广泛的是乳酸片球 菌（Pediococcuacidilactici)产生的片球菌素（pediocin)。片球菌素被认为是继nisin 之后第二个有望用于食品工业的细菌素。主要因为它由符合GRAS标准的片球菌产生，具有 广谱抑菌作用，在食品中性质稳定，进入消化道后迅速被蛋白酶消化等特征。由于乳酸片 球菌及其产生的片球菌素的上述特征，在发达的欧美国家已允许将其应用于食品和动物饲 料，作为食品防腐剂或饲料添加剂。在美国和欧洲最近批准实施的法规中，允许使用的都是 活的片球菌制剂，将其作为防腐剂和益生菌。而到目前为止，片球菌素尚未获得许可加入食 品，但美国FDA和美国农业部FSIS(FoodSafetyInspectionService)研宄实验室已研宄 了这些细菌素的杀菌使用效果，如果这些结果在更多的实验室得到证实，片球菌素和其他 细菌素有望获得许可应用到食品中。
[0006] 乳酸片球菌素由乳酸片球菌产生，对革兰氏阳性菌有很宽的抑菌谱，包括单核增 多症李氏杆菌（Listeriamonocytogenes)、产气荚膜梭菌（Clostridiumperfringens)、金 黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus)、奠肠球菌（Enterococcusfaecalis)等，其中对 李氏杆菌的高抑制活性是片球菌素的重要特性。现阶段乳酸片球菌素的研发仍然处于实验 室阶段，对于菌体培养的主要培养基为MRS。考虑到中试实验和后期大规模生产的效益问 题，有必要选择一种简单安全成本低廉的培养基，进行工业化生产。
【发明内容】
[0007] 为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种乳酸菌细菌素工业生产发酵培 养基及发酵条件，克服现有技术中乳酸片球菌素没有实现工业化生产的问题。
[0008] 本发明的技术方案是：
[0009] -种乳酸菌细菌素工业生产发酵培养基，所述发酵培养基成分为糖蜜35_40g/L， 玉米浆8-12g/L，磷酸氢二钾0. 5-0. 8g/L。
[0010] 优选的培养基成分为糖蜜36. 13g/L，玉米浆9. 00g/L，磷酸氢二钾0. 60g/L。
[0011] 一种乳酸菌细菌素工业生产发酵条件，其中通气比5. 8-6. 2vvm，转速130-160r/ min,接种量 1. 8-2. 0%。
[0012] 优选的发酵条件为通气比6vvm,转速150r/min,接种量2%。
[0013] 本发明的有益效果是：优化后的工业培养基配方使用糖蜜、玉米浆等工业副产品 作为主要生产基质，易于获得，降低生产成本，且乳酸片球菌素效价可达到1309. 60AU/mL， 是未优化前的2倍，适于促进乳酸片球菌素的大规模工业化生产。
【附图说明】
[0014]图1为乳酸片球菌素效价标准曲线；
[0015] 其中：抑菌圈直径差：不同浓度的片球菌素溶液与中心浓度（片球菌素溶液与PBS 缓冲液1:1混合，效价为320AU/mL)的片球菌素溶液抑菌圈直径的差值。
【具体实施方式】
[0016] 下面结合附图对本发明做进一步详细说明。
[0017] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0018] 糖蜜、玉米浆、黄豆饼粉、酵母粉、鱼粉购自天津市利发隆化工科技有限公司；玉米 淀粉为市售；乳清粉购自北京三元食品股份有限公司，前处理：浓度10 %，用2mol/L的盐酸 调节pH值为4. 5，115°C灭菌15min，离心去除沉淀，上清液121°C灭菌15min备用。
[0019] LiFlusGM全自动六联体发酵罐，韩国BioTron公司。
[0020] 实施例1
[0021] 乳酸片球菌素活性测定
[0022] 乳酸片球菌发酵液用2mol/L的HCI调节pH到2. 0,防止乳酸片球菌素吸附到细胞 上，70°C水浴30min，防止发酵液中的蛋白酶破坏细菌素。然后，8000r/min，4°C离心20min， 取上清液用2mol/L的NaOH调节pH到6.0,进行抑菌试验测定乳酸片球菌素效价。乳酸片 球菌素的抑菌活性实验参考管碟法。效价的测定采用二倍稀释法，以李氏杆菌为指示菌，细 菌素液依次用0. 02mol/L，pH6. 0的磷酸缓冲液（PBS)2倍稀释，用对指示菌显示抑菌圈的最 高稀释倍数表示细菌素活性，计算式为：AU/mL= 2nX(1000/x)，n表示对指示菌显示抑菌 圈的大小与牛津杯外径的差值不小于2mm的孔数；x表示每孔中的细菌素液加样体积。二 倍稀释法确定了乳酸片球菌培养16h后发酵液中乳酸片球菌素的效价为640AU/mL，抑菌圈 直径差与效价对数值呈线性关系，可绘出效价标准曲线（见图1)。
[0023] 实施例2
[0024] 优化工业培养基
[0025]1、改良培养基中的碳源、氮源
[0026] 发酵培养基中MRS中其余成分及含量不变，选择浓度均为20g/L的葡萄糖、蔗糖、 乳糖、乳清、玉米淀粉、糖蜜作为碳源，确定合适的碳源，并对最佳碳源的浓度进行优化。优 化结果为糖蜜为最优工业碳源，糖蜜发酵乳酸片球菌素的最佳浓度是35g/L。
[0027] 以35g/L糖蜜为最佳碳源，选择浓度均为20g/L的黄豆饼粉、酵母浸膏、玉米浆、酵 母粉、鱼粉作为氮源，确定合适氮源，并对其浓度进行优化。氮源中玉米浆发酵生产的乳酸 片球菌素的效价最大，其最佳质量浓度为15g/L。
[0028] MRS培养基中，用改良后的碳氮源，及糖蜜浓度为35g/L、玉米浆浓度为15g/L时， 37°C培养乳酸片球菌，16h时测定片球菌素效价为625. 00AU/M1。
[0029]2、优化培养基中的其他成分
[0030] 以35g/L糖蜜为最佳碳源，15g/L的玉米衆为最佳氮源，研宄添加浓度为2g/L的磷 酸氢二钾、5g/L的乙酸钠、2g/L柠檬酸铵、0. 58g/L的硫酸镁、0. 25g/L的硫酸锰、lg/L的吐 温-80,与不添加任何物质的糖蜜-玉米浆培养基进行比较，探索MRS培养基中各成分对乳 酸片球菌素效价的影响，并优化其最佳添加浓度。用DPS软件进行统计学分析，添加磷酸氢 二钾后相对于基础培养基，片球菌素效价显著提高（P〈〇. 05)，其最佳质量浓度是0. 5g/L。
[0031] 当培养基为35g/L的糖蜜浓度、15g/L的玉米浆、0. 5g/L的磷酸氢二钾时，37°C培 养乳酸片球菌，16h后测定片球菌素效价为820. 00AU/mL。
[0032] 3、优化培养基中糖蜜、玉米浆、磷酸氢二钾的配比
[0033] 根据实验所得的最佳碳源、氮源、无机盐浓度进行均匀设计实验，利用均匀设计表 U#12(121(l)进行实验设计，以取得最佳浓度配比。实验设计的因素和水平见表1。用均匀设 计软件对表1的数据进行多元二次逐步回归分析，得出乳酸片球菌素效价与各因素关系的 方程为：Y= 86. 1+67. 6X^10. 3X2+272X3-0. 894X^-5X43
[0034]F= 33. 52R2=0.9457,回归方程显著，可以很好地拟合乳酸片球菌素的发酵 情况。综合分析方程并根据实践经验得优化后的发酵培养基为：糖蜜36. 13g/L，玉米浆 9. 00g/L，磷酸氢二钾0. 60g/L。预测最优结果为：乳链片球菌素的效价达到1323. 59AU/mL。
[0035] 当工业培养基组分为糖蜜36g/L，玉米浆9g/L，磷酸氢二钾0.6g/L时，37°C培养 乳酸片球菌，16h后测定片球菌素效价为1309. 60AU/mL。
[0036] 表1均匀设计因素水平表及实验结果
[0037]
【主权项】
1. 一种乳酸菌细菌素工业生产发酵培养基，其特征在于，所述发酵培养基成分为糖蜜 35-40g/L，玉米浆 8-12g/L，磷酸氢二钾 0? 5-0. 8g/L。
2. 根据权利要求1所述乳酸菌细菌素工业生产发酵培养基，其特征在于，所述发酵培 养基成分为糖蜜36. 13g/L，玉米浆9. 00g/L，磷酸氢二钾0. 60g/L。
3. -种根据权利要求1所述乳酸菌细菌素工业生产发酵培养基的发酵条件，其特征在 于，其中通气比 5. 8-6. 2vvm,转速 130-160r/min,接种量 1. 8-2. 0%。
4. 根据权利要求3所述发酵条件，其特征在于，所述通气比6vvm,转速150r/min,接种 量2%。
【专利摘要】本发明公开了一种乳酸菌细菌素工业生产发酵培养基及发酵条件，优化发酵培养基配方为糖蜜35-40g/L,玉米浆8-12g/L,磷酸氢二钾0.5-0.8g/L，发酵罐优化发酵条件为通气比5.8-6.2vvm,转速130-160r/min,接种量1.8-2.0％。优化后的工业培养基配方使用糖蜜、玉米浆等工业副产品作为主要生产基质，易于获得，降低生产成本，且制得乳酸片球菌素效价是未优化前的2倍，适于促进乳酸片球菌素的大规模工业化生产。
【IPC分类】C12P21-00, C12R1-01
【公开号】CN104531811
【申请号】CN201410811349
【发明人】周志江, 王静, 韩烨, 肖华志
【申请人】天津大学
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2014年12月22日