一种利用蜜枣废水作为培养基进行乳酸菌培养的方法
【专利摘要】本发明涉及一种利用蜜枣废水发酵生产乳酸菌的方法，包括将无机盐等物质加入到所述废糖液中，配置成优化的发酵培养基，通过优化发酵条件，采用二阶段降温发酵，即得到发酵优化的方法，最终得到了高浓度的乳酸菌菌体。本发明的发酵方法直接以蜜枣废水作为碳氮源，减少了发酵成本。
【专利说明】
-种利用蜜専废水作为培养基进行乳酸菌培养的方法
技术领域
[0001] 本发明设及一种蜜要(钱)加工废水综合处理及资源化的方法，尤其是蜜要加工废 水综合处理、蜜糖回收，燃煤锅炉脱硫和要加工废水联合工艺的处理方法。
【背景技术】
[0002] 要树是黄河流域最古老的树种之一，距今已有数千年的栽培历史。河北、河南、山 西、陕西、新疆等地是我国主要要产地。蜜要是传统美味的消闲食品，且具有丰富的营养价 值，在国内外有着巨大的市场和良好的声誉。蜜要加工能够提高农产品附加值和带动地方 经济。但蜜要加工也是一个污染较大的行业，蜜要加工产生的高浓废水和生产锅炉烟尘污 染一直是困扰着企业进一步健康发展所面临的难题。特别是一些蜜要加工小作坊生产废水 的乱排造成周边环境污染和环保部口的高度重视，使得蜜要(蜜钱)加工污染防治成为当地 环境污染治理的重要课题。
[0003] 蜜要加工废水主要有原要的清洗废水、设备和地面冲洗水等较低浓度废水和蜜要 经糖煮后冲洗表面糖蜜的高浓废水。高浓废水主要成分是糖，除少部分回用W减少补充新 鲜水和原糖之外，大部分排掉。蜜要糖煮后的冲洗水COD高达19万(mg/L)，经下水道与洗要 水和地面、设备清洗水混合成为外排的综合废水，其C0D = 60000mg/L。如此高浓废水直接处 理势必造成投资过高，企业难W承受。CN 103193358 A中公开了一种蜜要加工废水的综合 处理及资源化方法。采用分质处理蜜要加工废水:高含糖废水通过多效蒸发使糖分回收，不 仅大幅减轻污水处理负荷而且产生回收糖可观的经济效益;要清洗水、地面清洁污水和其 他生活污水汇总处理;此部分污水处理与燃煤锅炉烟气脱硫同步运行，利用污水中的有机 污染物作为营养源生物脱硫的同时，污水也得到一定程度的处理、水溫上升---有利后继的 生化处理。上述生化处理出水经生物碳深度处理再经微滤和RO反渗透双膜处理，降低出水 盐度达到锅炉软化水要求，进一步减少蜜要加工废水排放量和传统锅炉用水软化酸碱的消 耗和排放。该方法操作复杂，资源消耗量巨大也不实用。
[0004] 使用微生物来处理废水在现有技术中已经有了很多例子。比如，中国人民大学于 2012年10月3日申请的、发明名称为"利用一株光合细菌处理淀粉废水并实现废水资源化的 方法"、公布号为CN102701460A的发明专利申请，针对淀粉加工废水采用光合细菌发酵，并 收集菌体实现资源化，其所用的光合细菌是球形红细菌，采用的淀粉废水特指为利用玉米、 馨类等加工淀粉产生的废水，该污水浓度极高，COD为8000-30000mg/l，为了增加菌剂的浓 度，该发明专利申请引入高浓度苹果酸(400mg)，增加了生产成本，该发明专利申请还没有 详细说明控制杂菌问题。另外，发明名称为"利用光合细菌处理食品加工废水并实现资源化 的方法"的CN103058387B掲示其所用光合细菌为沼泽红假单胞菌(戊食品加工废水特指为 粮蜜废水、酒糟废水、果胶废水W及牛奶制品废水，废水浓度极高，其COD为8000-30000mg/l， 该发明专利申请中投加小分子碳源物质到终浓度为160-2000mg及小分子氮源物质到终浓 度为55-lOOOmg/l。但是针对蜜要废水进行处理的实例并不多，应用也不广泛。
[0005] CN 104026507 A中公开了一种利用蜜要废糖液生产要果的方法，包括W下步骤： I)将巧樣酸锭，化抽K)4及碳酸巧依次加入到所述废糖液中，配置成培养基;2)将所述培养基 进行灭菌，然后再加入木醋杆菌种子液，在25~30°C的溫度下，静置培养5~10天，即得到所 述要果。本发明是利用丢弃的红要汁液，利用其作为培养基来生产一种食品原料一一要果。 由于要汁液中营养高，可W直接作为碳源，减少碳源成本。CN 103695352 A中公开了一种针 对大要加工厂废水采用微生物发酵工艺制造水质处理剂的方法，所用水质处理剂中的微生 物成分包括枯草芽抱杆菌、地衣芽抱杆菌、乳酸菌，用量为2~70%。利用上述微生物进行污 水处理的工艺流程为:针对废水予W自然沉降，收集液体，按比例加入微生物在30~50°进 行有氧发酵，并予W充气;在-发酵终点后再加入焦糖进一步发酵，然后再加入枯草芽抱杆 菌，直至发酵至终点，分装成品即可。本发明技术解决了大要加工厂废水处理问题，生产出 产品能用于农业、水产养殖、海洋赤潮、淡水，从而实现污水处理零排放。上述产品能广泛应 用于农业、水产养殖、湖泊水华、海洋赤潮的治理。该方法能够使得资源最大化的得到利用。
[0006] 乳酸菌生长的营养要求较高，其培养基组成除了必须含有充足的碳源、氮源、无机 盐外，几乎每种乳酸菌都有其特殊的生长因子需求，如维生素、小分子氨基酸、核酸衍生物 等，因此国内外培养乳酸菌制剂使用的培养基(乳清粉、各种奶粉、MRS培养基等）的原料均 十分昂贵。另外，乳酸菌在生长过程中分泌有机酸类代谢产物，抑制菌体增殖，运些都直接 影响乳酸菌的高密度培养。目前乳酸菌饲料W青胆饲料的形式较为常见，东北农业大学的 刘飞（刘飞；范丽萍等.乳酸菌发酵青胆对奶牛产奶量及乳成分的影响.家畜生态学报， 2006,27(4) :38-40)等W玉米乳杆菌和坚强肠球菌发酵玉米青胆，在第30天青胆饲料成熟 后测得乳杆菌活菌含量为4X107CFU/g鲜样，发酵周期较长，活菌含量低。
[0007] 迄今为止，已报导的乳酸菌的制备几乎都是利用W葡萄糖、蛋白腺、酵母膏、无机 盐、微量元素、维生素等为原料合成的培养基来进行发酵的，如中国专利《乳酸菌生物饲料 添加剂的制备方法》(专利号= 201010122147)、《一种饲用乳酸菌高密度发酵培养基及其发 酵方法K专利号201110116555)，中国专利申请《乳酸菌的一种高密度培养方法》（申请号 200710004941.2 .)、《一种乳酸菌高密度培养方法》（申请号200910057650)，W及《高效乳酸 菌直投式发酵剂的研制》谭欢.[J].湖南农业科学，2012,（9) :102-104,107等文都使用了上 述方法，培养后液体中乳酸菌计数均可达109c化/ml W上，但是原料成本高，原料成本占到 发酵成本的30 %-50% ;并且还要对培养基进行全程灭菌，同时还要恒溫到36°C或42°C进行 培养，能源消耗也高;此外发酵废液的处理也非常复杂。偶见用生物质原料如渡萝皮、平茹 浸汁和马铃馨汁来进行增菌的报道，《新型乳酸菌增菌培养基研究》杜磊等[J]乳业科学与 技术，.2012,35(1)4-7.)此方法除具有需要灭菌、恒溫等能源消耗高之缺点外，还存在原料 来源不稳定、不易保存等缺陷。因此，在我国还没有实现乳酸菌的工业化生产。
[000引综上所述，本发明首次提出W蜜要废水为主要原料，经优化培养基配方，并W液态 发酵工艺培养乳酸菌，生产高附加值的活菌饲料，本发明的关键在于W蜜要废水替代传统 乳酸菌培养所使用的高成本原料，降低乳酸菌培养成本，同时使饲料活菌含量达到规定要 求。
【发明内容】
[0009]本发明的目的是通过生物资源转化的手段，将蜜要废水经微生物发酵制成富含活 性乳酸菌的高档饲料，并进行大规模工业化生产。
[0010] 本发明的技术方案:一种利用蜜要废水培养乳酸菌及生产乳酸活菌饲料的方法， 采用饲用乳酸菌为培养菌株，W蜜要废水为主要原料，经培养基的优化，采用二次分段液态 发酵的方式，制成乳酸菌含量高的饲料产品；
[0011] 其中蜜要废水的COD高达90000mg/L。
[0012] 菌种:植物乳杆菌，购自生合生物科技(南京)有限公司。
[0013] 液态发酵培养基Wg/L计:蜜要废水中直接添加 KsHP化.3此0 1.5g/L、乙酸钢2g/L、 巧樣酸S锭5g/L、MgS〇4.7出0 1.5g/L、MnS〇4.H2〇 0.5g/L、维生素 Bi9.5mg/L和吐溫-80 3.51111/1，9巧直6.2-6.6，121°(：灭菌2〇111111;
[0014] 发酵培养条件：（1)将冷冻保藏的植物乳杆菌接种于MRS液体培养基中，于37°C培 养12小时，连续活化S代后，作为种子液；（2)蜜要废水中直接添加KsHP化.3此0 1.5g/L、乙 酸钢2g/L、巧樣酸S锭5g/L、MgS〇4.7出0 1.5g/L、MnS〇4.出0 0.5g/L、维生素Bi 9.5mg/L和吐 溫-80 3.5ml/L，pH值调至6.6;(3)按4乂八％的接种量将步骤（1)的种子液接种于步骤(2)的 发酵培养基中于33°C，转速30巧m振荡培养；（4)当发酵培养基的抑值降至5.別寸，流加使用 液态发酵培养基配制的IOmol/L化0田容液使培养基的pH值稳定在6.6，发酵过程中不通气， 于30°C，转速25rpm条件下降溫二次发酵12小时，获得的植物乳杆菌发酵液中活菌数达8* l〇WCFU/mlW上。
[0015] 本发明的有益效果:本发明选用蜜要废水为主要生产原料，培养饲用乳酸菌，使废 物资源化，降低生产乳酸菌的成本。本发明优化了乳酸菌的培养基成分，并采用液态二阶段 发酵的方式，高密度培养饲料用乳酸菌，在较短的时间内即可实现菌落个数lO^c化/mL。
【具体实施方式】
[0016] 实施例1.发酵培养基的优化
[0017] 使用蜜要废水，分别与K2册化.3此0、乙酸钢、巧樣酸S锭、MgS化.7此0、MnS〇4.此0、 维生素Bi和吐溫-80分别进行正交实验，检测最佳的混合比例，从而实现最优的发酵效果； [001引通过验证，发现培养基的配方为蜜要废水中直接添加K2HP化.3出0 1.5g/L、乙酸钢 2g/L、巧樣酸S锭5g/L、MgS04.7出0 1.5g/L、MnS04.出0 0.5g/L、维生素Bi 9.5mg/L和吐溫- 80 3.5ml/L，抑值6.2-6.6的时候，乳酸菌的发酵效果最好，因此选取该培养基配方为最佳 的发酵培养基配方。
[0019] 实施例2发酵条件的优化
[0020] 1、菌株的活化
[0021 ]将冷冻保藏的植物乳杆菌接种于MRS液体培养基中，于37°C培养12小时，连续活化 =代后，作为种子液;活化=代之后，菌株的活性最好，比活化一代或者二代的菌株的活性 都有大幅度的提局。
[0022] 2、发酵条件的选择
[0023] 接种量对乳酸菌生长的影响：合适的接种量既要缩短发酵周期，又要保证菌体能 正常生长。接种量过低会延长发酵周期，过高又会造成菌体提前老化。实验证明：10%的接 种量能使活菌含量达到理想水平，同时发酵周期也不是太长。
[0024] 初始pH值对乳酸菌生长的影响:抑值过高或过低都不利于乳酸菌的大量生长，通 过实验确定植物乳酸菌生长的最适pH为6.6。
[0025] 发明人列举如下六种具体的方法，如下所述：
[0026] 方法(1)，W10%的接种量将种子液接入液态发酵培养基中，接种前先测定种子液 OD值，接种好后置于37°C培养箱中静置培养1她~24h，测活菌数。
[0027] 方法(2)，W4%的接种量将种子液接入液态发酵培养基中，接种前先测定种子液 OD值，接种好后置于37°C培养箱中静置培养1她~24h，测活菌数。
[0028] 方法(3)，W10%的接种量将种子液接入液态发酵培养基中，接种前先测定种子液 OD值，接种好后置于33°C培养箱中静置培养1她~24h，测活菌数。
[0029] 方法(4)，按10%的接种量将种子液接种于发酵培养基中于33°C，接种前先测定种 子液OD值，转速30rpm振荡培养;当发酵培养基的pH值降至5.別寸，流加使用液态发酵培养基 配制的lOmol/L化OH溶液使培养基的pH值稳定在6.6，发酵过程中不通气，于30°C、转速 25巧m条件下降溫二次发酵12小时，测活菌数。
[0030] 方法(5)，按10%的接种量将种子液接种于发酵培养基中于33°C，接种前先测定种 子液OD值，转速30rpm振荡培养;当发酵培养基的pH值降至5.別寸，流加使用液态发酵培养基 配制的lOmol/L化OH溶液使培养基的pH值稳定在6.6，发酵过程中不通气，于33 °C，转速 25巧m条件下二次发酵12小时，测活菌数。
[0031] 方法(6)，按10%的接种量将种子液接种于CN 104004679 B中公开的发酵培养基 中于33°C，接种前先测定种子液OD值，转速30rpm振荡培养；当发酵培养基的pH值降至5.8 时，流加使用液态发酵培养基配制的lOmol/L NaO田容液使培养基的抑值稳定在6.6，发酵过 程中不通气，于30°C、转速25巧m条件下降溫二次发酵12小时，测活菌数。
[0032] 活菌检测采用平板菌落计数法。
[0033] 结果如下：
[0034]
[0035]
[0036] 从W上结果可W看出，采用本发明的发酵培养基W及相应的二阶段降溫发酵策略 可W使得发酵之后产生的菌落总数得到较大幅度的提高。比现有技术的发酵方法都要优 越。
[0037] 实施例3处理后废水指标
[0038] 将发酵后的发酵液经离屯、，收集菌体后，采用《重铭酸盐法(GB11914-89)》测定 C0D，分光光度法测定色度。结果为COD去除98.3%，色度去除96.5%。大大降低了废水的处 理条件。具有较好的处理效果。
[0039] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可W对之作一些修改或改进，运对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的运些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1. 一种乳酸菌发酵的方法，其特征在于采用培养基进行乳酸菌进行发酵。2. -种液态发酵培养基，其特征在于各组分以g/L计：在蜜枣废水中直接添加 K2HP〇4.3H20 1.5g/L、乙酸钠2g/L、柠檬酸三铵5g/L、MgS〇4.7H20 1.5g/L、MnS〇4.H20 0.5g/ 1、维生素出9.511^/1和吐温-80 3.51111/1，？!1值6.2-6.6。3. -种利用蜜枣废水进行乳酸菌发酵的方法，包括：（I)将冷冻保藏的植物乳杆菌接种 于MRS液体培养基中，于37°C培养12小时，连续活化三代后，作为种子液；（2)蜜枣废水中直 接添加 Κ2ΗΡ〇4· 3H20 1 · 5g/L、乙酸钠2g/L、柠檬酸三铵 5g/L、MgS〇4.7H20 1 · 5g/L、MnS〇4.H20 0.5g/L、维生素 B1 9.5mg/L和吐温-80 3.5ml/L，pH值调至6.6;(3)按扣八％的接种量将步 骤（I)的种子液接种于步骤(2)的发酵培养基中于33°C，转速30rpm振荡培养；（4)当发酵培 养基的pH值降至5.8时，流加使用液态发酵培养基配制的lOmol/L NaOH溶液使培养基的pH 值稳定在6.6，发酵过程中不通气，于30°C，转速25rpm条件下降温二次发酵12小时。
【文档编号】C12R1/25GK105925515SQ201610551933
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年7月14日
【发明人】苏永鹏
【申请人】贝嘉美（天津）生物技术研发有限公司