专利名称：免疫调节活性高的乳酸菌的培养法的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于提高乳酸菌的免疫调节活性的培养方法以及使用该培 养方法的免疫功能调节剂的制造方法。
背景技术：
支气管哮喘、过敏性鼻炎、特应性皮炎等过敏疾病在这数十年中急剧
增加，目前认为至少有人口的约1/5左右患有某些过敏反应疾病。目前很多 的过敏反应治疗药物为对症疗法性药物，从得病患者数量增加和伴随着长 期使用的副作用的观点出发，也期望着更加有效的治疗方法(非专利文献 1)。近年来，公开了在双盲检验安慰剂试验中，作为乳酸菌的一种的鼠李 糖乳杆菌GG株(Lactobacillus rhamnosusATCC 53103株)的给药将高危儿 童的特应性疾病的发病抑制至大约半数(非专利文献2)，可以说使用乳酸 菌是不伴有副作用地用于预防和/或治疗过敏反应的简单、有效的方法。乳 酸菌具有这样的效果的一个理由在于，当它被巨噬细胞或树突状细胞等担 任自然免疫的细胞吞噬时诱导产生了 IL-12(p70)(下文也称为IL-12)(非专 利文献3)。
IL-12(p70)促进未分化T细胞向I型的辅助T细胞(下文也称为Thl 细胞)分化，从而使Thl/Th2平衡向Thl侧偏移(非专利文献3)。向II型 的辅助T细胞(下文也称为Th2细胞)侧偏移的Thl/Th2平衡诱导产生抗 原特异性的IgE，其是导致过敏反应发病的一个原因，因此诱导由自然免疫 担任细胞产生IL-12、改善Thl/Th2平衡的活性就成为在评价菌株的过敏反 应改善效果方面的一个重要指标。这种乳酸菌的免疫调节活性即使是同种 同属的乳酸菌，也会因为菌株的不同而有很大不同，因此大力地进行了具 有高免疫调节活性的益生菌株的筛选和其应用研究(非专利文献4)。这样 的研究的结果是，到目前为止，提出了使用各种乳酸菌的过敏反应预防和/ 或治疗剂。但是，例如专利文献1中公开的乳酸菌(副干酪乳杆菌，Lactobacillus paracasei KW3110株)，虽然从18禾中100菌株以上的乳酸菌中 筛选出了 IL-12产生促进效果以及Thl/Th2平衡改善效果高的菌株，但完全 没有研究其菌体的培养条件对免疫调节活性的影响。
研究乳酸菌西菌株不同而作用和活性的程度不同、以及其有效成分的 报道很多，但是因菌的培养条件不同而免疫调节活性不同的报道例却只有2 篇。Haller等人报道了稳定期菌体的对人末梢血单核细胞的TNF-ci的产生 诱导效果比对数增殖期的菌体高(非专利文献5)。另一方面，报道了即使 在体内中，诱导Thl/Th2平衡的活性也因乳杆菌属乳酸菌的培养期的不同 而不同。Massen等人为了研究乳酸菌的免疫调节活性，通过给小鼠经口给 予处于对数增殖期和稳定期的菌体，然后测定血中IgG2a/IgGl的比值，从 而对Thl/Th2平衡进行了研究。其结果报道了稳定期的菌体比处于对数增 殖期的菌体更能诱导Th2反应(非专利文献6)。但是，这些报道仅公开了 因菌体的培养期不同而免疫调节活性不同的现象，而完全没有研究是否只 有培养时间是重要的，以及其它的环境因素是否有影响。关于菌体的培养 条件对免疫调节活性的影响的研究，对决定进行用于制造免疫调节活性更 高的菌体的工业生产时的制造工艺可以说是重要的，但至今仍然没有此类 的研究。如此，目前在使用现有的乳酸菌来制备目标过敏反应预防和/或治 疗剂、或者过敏反应预防和/或治疗用食品组合物的方法方面，仍然有许多 有待于改进的地方。
专利文献l:日本专利第3585487号公报
非专利文献1:赤星光輝，玉利真由美，白川太郎、「7P》年一疾患 〖匚恕汁3最近0話題」、最新医学、58(2)、 pp. 7-14(2003)
非专禾U文献2: Kalliomaki M, Salminen S, Arvilommi H, Kero P， Koskinen P， Isolauri E, "Probiotics in primary prevention of atopic disease: a randomised placebo-controlled trial.", Lancet, 357(9262), pp. 1076-1079 (2001)
一^专禾U文献3: Cross ML, Gill HS, "Can immunoregulatory lactic acid bacteria be used as dietary supplements to limit allergies ", International Archives of Allergy and Immunology, 125， pp.112-119 (2001)
非专禾U文献4: Lee J, Ametani A， Enomoto A, Sato Y， Motoshima H， Ike F, Kaminogawa S, "Screening for the immunopotentiating activity of foodmicroorganisms and enhancement of the immune response by Bifidobacterium adolescentis Ml01-4.，，, Bioscience Biotechnology and Biochemistry, 57(12)， pp.2127-2132 (1993)
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非专禾U文献6: Maassen CB, Boersma WJA, van Holten-Neelen C， Claassen E, Laman JD, "Growth phase of orally administered Lactobacillus strains differentially affects IgGl/IgG2a ratio for soluble antigens: implications for vaccine development,", Vaccine 、 21(21-22)， pp.2751-2757 (2003)
发明内容
艮口，本发明的课题是要找到提高乳酸菌免疫调节功能的培养方法和使 用该培养方法的免疫功能调节剂的制造方法。
本发明是为了解决上述课题而完成的。本发明人等已在国际申请 WO2006/093022中报道了作为格氏乳酸杆菌属乳酸菌的格氏乳酸杆菌 OLL2809 (Lactobacillus gasseri OLL2809，以下也称为L. gasseri OLL2809) 菌株具有以过敏反应的预防和治疗为首的免疫功能调节活性，并且就乳酸 菌的培养条件对来自小鼠脾细胞的IL-12(p70)的产生诱导活性的影响进行 了锐意研究。结果发现，作为与上述乳酸菌的免疫功能调节活性有关的因 子，培养液的pH特别地有较大相关。另外，不仅格氏乳酸杆菌，对于嗜淀 粉乳杆菌(以下也称为L. amylovorus)以及巻曲乳杆菌(以下也称为L. crispatus)等其它的乳酸菌也都发现培养液的pH与免疫功能调节效果相关， 从而完成了本发明。
艮口，本发明提供下述内容 一种含有乳酸菌的免疫功能调节剂的制造方法，其包括在pH 3.5~pH5.0的培养基中对乳酸菌进行培养的工序。如[l]所述的免疫功能调节剂的制造方法，其中，所述乳酸菌为具 有IL-12产生促进效果的乳酸菌。
5[3]如[1]或[2]所述的免疫功能调节剂的制造方法，其中，所述乳酸菌
为乳杆菌属乳酸菌。如[1] [3]任一项所述的免疫功能调节剂的制造方法，其中，所述 乳酸菌为选自格氏乳酸杆菌OLL2809菌株(Lactobacillus gasseri OLL2809， 保藏号NITEBP-72)、嗜淀粉乳杆菌JCM 1126T以及巻曲乳杆菌JCM 1185T 中的至少一种乳酸菌。 —种免疫功能调节剂，其是通过[1] [4]任一项所述的制造方法制 造的。 —种过敏反应预防和/或治疗用饮料食品，其含有[5]所述的免疫功 能调节剂。 —种过敏反应预防和/或治疗用药品，其含有[5]所述的免疫功能调 节剂。 —种[5]所述的免疫功能调节剂用于制造过敏反应预防和/或治疗用 药品或者过敏反应预防和/或治疗用饮料食品的用途。
如下文实施例所示，使用本发明中包括的乳酸菌的培养方法能够提高 乳酸菌的免疫调节活性。另外，利用使用该方法培养的乳酸菌，实现了具 有高活性的免疫功能调节剂的制造。由此，也能够提供对过敏反应预防和/ 或治疗等有效的、免疫调节活性高的饮料食品和药品。
图1为用培养时间表示的L. gasseri OLL2809的生长以及IL-12产生促 进效果的随时间变化的图。黑圈(參)表示OD66Q、柱表示小鼠脾细胞的培养 液上清中的IL-12(p70)(pg/mL)。 IL-12的数值用平均值士标准偏差(n=3) 表示。NT:未检测。
图2为表示培养基和培养基成分对L. gasseri OLL2809的IL-12产生促 进效果的影响的图。在向MRS、 GAM或GAM培养基中添加葡萄糖而成的 培养基中的L. gasseri OLL2809的生长(A)、培养18小时后的菌体的IL-12 产生促进效果(B)以及IL-12产生促进效果(IL-12(P70)(pg/mL))的平均值与培 养18小时后的pH的相关图(C)。在图(A)中，黑圈(參)表示MRS培养基、 黑三角表示GAM培养基、黑四角表示GAM培养基+葡萄糖(终浓度(培养前培养基的最终调节浓度)为5g/L)、白圈(〇)表示GAM培养基+葡 萄糖(终浓度为10g/L)、白三角(△)表示GAM培养基+葡萄糖(终浓度 为20g/L)。在图(B)中，横轴数字表示培养基中的葡萄糖浓度(终浓度，g/L)。 另外，图(B)表示平均值土标准偏差(n=3)。 *表示？<0.05 (Student的重复 测量t检验)、弁表示p0.05 (Dunnet检验)。
图3为表示控制了 pH的L. gasseri OLL2809的培养(A:活菌数(log cfu/mL)、 B: pH)以及IL-12产生促进效果(C)的随着时间变化的图。在 (A)和(B)中，黑圈(參)表示设定pH为4、黑三角表示设定pH为5、黑四 角表示设定pH为6。
图4为表示向MRS培养基中添加CaC03对L. amylovorus JCM 1126T 和L. crispatus JCM 11857的IL-12产生促进效果的影响的图。表示平均值士 标准偏差(n=3)。 *: p<0.05 (Student的重复测量t检验)。
图5为表示在不同的pH缓冲液中孵育的L. gasseri OLL2809的IL-12 产生促进效果的变化的图。"加热"表示加热处理样品，"非加热"表示非 加热样品。对照表示在MRS培养基中静置培养18小时后、在75'C下加热 处理60分钟而得到的L. gasseri OLL2809的冻干菌粉末。表示平均值士标 准偏差(n=3)。
具体实施例方式
以下详细地说明本发明。但是，本发明并不限于以下的优选实施方式， 其可以在本发明的范围内自由地变更。
本发明涉及含有乳酸菌作为有效成分的免疫功能调节剂的制造方法。 本发明的制造方法中包括用于高效地获得乳酸菌所具有的免疫功能调节活 性的乳酸菌的培养方法。本发明人等针对各种乳酸菌(L. gasseri、 L. amylovorus及L. crispatus)以来自小鼠来源的脾细胞的IL-12的产生促进效 果为指标对各种培养条件下的免疫功能调节活性进行了研究。结果发现， 作为与上述乳酸菌的免疫功能调节活性有关的因子，培养液的pH特别地有 较大相关。因此，通过使用本发明的制造方法，能够提供对包括食物过敏 反应在内的各种过敏反应的预防和/或治疗有效的、新型的过敏反应预防和/ 或治疗剂、或者含有该预防和/或治疗剂的过敏反应预防和/或治疗用食品组合物。
乳酸菌是吸收(日文原文为資化)葡萄糖并以50%以上的对糖收率 生产乳酸的菌的总称，为在生理学性质上属于革兰氏阳性菌的球菌或杆菌， 其特征是没有运动性、没有形成胞子的能力以及过氧化氢酶阴性等。乳酸 菌从植物的表皮、哺乳动物的肠道、海洋、土壤、发酵食品等各种各样的 环境中分离出来，在腌制品或酱油等发酵食品中不仅有助于味道和质地的 形成，而且具有产生乳酸或细菌素等抗菌性物质的能力，因此自古以来一 直以发酵乳等的形式而被世界各地的人们食用。另外，在哺乳动物的肠道 中，对宿主具有各种的生理性影响己是众所周知的事实，可以说是一种安
全性极高的微生物。到目前为止，乳酸菌被分类为乳球菌(Lactococcus) 属、乳杆菌(Lactobacillus)属、明串珠菌(Leuconostoc)属、片球菌
(Pediococcus)属、f连球菌(Streptococcus)属、魏斯氏菌(Wissella)属、 四体球菌(Tetragenococcus )属、酒球菌(Oenococcus )属、肠球菌
(Enterococcus)属、漫游球菌(Vagococcus)属、肉食杆菌(Camobacterium) 属的11个属。在本发明的免疫功能调节剂的制造方法中，可以使用这些乳 酸菌。作为适当的例子，可列举出格氏乳酸杆菌OLL2809菌株(保藏号为 NITEBP-72)、嗜淀粉乳杆菌JCM1126T以及巻曲乳杆菌JCM11857，但并 不限于这些例子。
在本发明的制造方法中，取上述乳酸菌置入培养基并在一定范围的pH 下进行培养。作为培养方法，也可以用分批培养、分次培养、流加培养、 连续培养、厌氧培养、通气培养、振荡培养、静置培养、搅拌培养、试管 培养、箱内培养、瓶内培养、发酵器培养(fermentor culture)、发酵罐培养 (jar fermentor culture)等中的任一方法来进行培养。
作为本发明的制造方法中使用的乳酸菌培养用培养基，可以使用通常 用于乳酸菌培养的培养基。即，只要在除了主碳源之外还适度地含有氮源、 无机物的其它营养物质的培养基中的任一种培养基即可使用。作为碳源， 可以根据所用菌的吸收性来使用乳糖、葡萄糖、蔗糖、果糖、淀粉水解物、 废糖蜜等。作为氮源，可以使用酪蛋白的水解物、乳清蛋白质水解物、大 豆蛋白质水解物等有机含氮物。另外，作为增殖促进剂，可以使用肉提取 物、鱼肉提取物、酵母提取物等。作为市售的培养基，例如可以使用Lactobacilli MRS Broth (Becton Dickinson)、 GAM培养基(日水制药)等， 或者进一步作为添加有上述成分的培养基使用，但并不限于这些例子。
乳酸菌的培养优选在厌氧条件下进行，但也可以是在利用通常所用的 液体静置培养等所产生的微好氧条件下。厌氧培养可以单独或组合使用在 碳气或非活泼性气体(氮气等)等的通气下进行培养的方法等公知的手法， 还可以是其它方法。培养温度一般优选为20 40'C，但只要是菌生长的温度 则也可以是其它的温度条件。培养时间通常优选为10~24小时，但只要是 菌可以生长的时间，则也可以是其它的培养时间。
菌体增殖的最适pH因菌株的不同而不同，但多数的乳酸菌大致在 5.5 7.0的范围之内(James JA， Lee BH, "Cultural conditions for production of glucoamylase from Lactobacillus amylovorus ATCC 33621.，，, J Appl Bacteriol、 79(5)， pp. 499-505(1995); Pettersson, H誦E., "Studies on batch production of bacterial concentrates from mixed species lactic starters." Applied Microbiology. 1975.29(2): 133-140.)，通常在工业生产中，为了得到 最大的菌体量，在最适pH下实施中和培养的方法。但是，考虑到用于高效 地工业化培养IL-12产生促进效果高的菌体的培养条件与用于高效地得到 菌体量的培养条件不同，有必要对其进行研究。
在本发明的制造方法中，优选将乳酸菌培养中培养基的pH维持在 3.5~5.5，优选在3.5~5.0，进一步优选在4.5以下，例如维持在3.5~4.5、 3.5 4.4、 3.8~4.4、 4.0 4.5、 3.5-4.0等下。
只要能够提高乳酸菌的免疫功能调节活性，也可以是其它的pH条件。 另外，可以在培养前或培养中，向培养基中适当添加通常使用的酸、碱、 缓冲剂、二氧化碳等添加剂以对培养基的pH进行调节。另外，本发明制造 方法中的pH调节，也可以利用乳酸菌自身产生的酸，为了调节乳酸菌的酸 产生，可以用葡萄糖等营养成分对培养基进行强化。
在本发明制造方法中的PH调节，可以按照使整个培养工序的pH维持 恒定的方式进行调节，也可以在培养工序过程中改变pH。例如，可以在适 于增加乳酸菌的菌体量的pH下进行培养，在菌体量增加后，改变为适于提 高乳酸菌的免疫功能调节活性的pH来进行培养。在进行作为工业化培养的 中和培养的情况下， 一般来说，例如多调节到pH为5.5 7左右。本发明的
9制造方法可以如下进行培养在将乳酸菌在这样的pH下培养后，再改变为 适于提高本发明的乳酸菌的免疫功能调节活性的pH。
接着将通过上述培养方法培养的乳酸菌保持原样或再进行洗涤、浓縮、 破碎、干燥、发酵或加热等处理，从而完成本发明的免疫功能调节剂。 ; 本发明的免疫功能调节剂可以以各种状态含有通过上述培养方法得到 的乳酸菌，例如作为乳酸菌悬浮液、乳酸菌培养物(菌体、培养上清液(含 有培养基成分))、乳酸菌发酵物(乳酸菌饮料、酸乳、酸奶酪等)、乳酸菌 处理物等使用。
作为本发明的免疫功能调节剂，可以将培养结束后的乳酸菌培养液直 '接使用，或将其浓缩制成浓縮物使用，或者进一步将浓縮物干燥后使用。 对该菌体浓度没有特别限定，但在浓縮液中优选为4xl(T个/g以上、在干 燥物中优选为5xl0"个/g以上。
本发明的免疫功能调节剂可以直接含有通过上述培养法得到的上述乳 酸菌，或也可以以对乳酸菌实施了某些处理的乳酸菌处理物的形式含有。 作为本发明中使用的乳酸菌处理物，例如可列举出乳酸菌、乳酸菌含有物、 发酵乳的浓縮物、糊化物、干燥物(选自喷雾干燥物、冷冻干燥物、真空 干燥物、滚筒干燥物中的至少一种)、液状物、稀释物、破碎物等。另外， 作为乳酸菌，可以适当使用活菌体、湿润菌体、干燥菌体等。还可以是实 施了杀菌、即实施了加热杀菌处理、放射线杀菌处理或破碎处理等的死菌 体。还可以添加到奶粉等具有生物学规格的药品和/或饮料食品中，与药品 和/或饮料食品的形态等无关，可应用在各种药品和/或饮料食品中。
L. gasseri OLL2809是在从健康人粪便中单独分离的273株的乳杆菌属 乳酸菌中，在体外试验中以具有强烈诱导小鼠脾细胞产生IL-12、改善 Thl/Th2平衡为特征而筛选出来的。另外，在将本菌株经口给予过敏反应模 型小鼠时，通过诱导脾细胞产生IL-12、抑制脾细胞和肠系膜淋巴结细胞产 生IL-4，改善Thl/Th2平衡，从而抑制血清中的抗原特异性IgE (Sashihara T, Sueki N, Ikegami S， "An analysis of the effectiveness of heat-killed lactic acid bacteria in alleviating allergic diseases.", Journal of Dairy Science, 89， pp.2846-2855(2006)、及国际申请WO2006/093022)。从这点来说，强烈诱 导IL-12产生的菌株可以说是过敏反应改善效果高的菌株。本发明人等将格氏乳酸杆菌OLL2809株保藏在独立行政法人产品评价 技术基础机构专利微生物保藏中心。以下记载了特定保藏的内容。
(1) 保藏机构名称独立行政法人产品评价技术基础机构专利微生
物保藏中心
(2) 联系地址T292-0818日本千葉県木更津巿力vf^鎌足2-5-8
电话号码0438-20-5580
(3) 保藏号NITEBP-72
(4) 用于识别的表示丄acto6ad〃w OLL2809
(5) 原保藏日平成17年(2005年)2月1日
(6) 向根据布达佩斯条约的保藏的转移日2006年1月18日 格氏乳酸杆菌OLL2809株(保藏号为NITEBP-72)是革兰氏阳性杆菌，
在乳杆菌MRS琼脂Difco上的克隆形态为圆形、淡黄色、扁平状。作为生 理学特征，具有同乳酸发酵(homolactic fermentation,又称为纯乳酸发酵) 形式、45'C下的发育性，对葡萄糖、甘露糖、果糖、半乳糖、蔗糖、纤维 二糖、乳糖、海藻糖具有发酵性。在菌体增殖中，培养中的培养基的pH优 选维持在6.0 7.0。
本发明的制造方法在后文描述的实施例中可见IL-12产生促进效果的 上升，不仅格氏乳酸杆菌OLL2809 (保藏号为NITE BP-72)、嗜淀粉乳杆 菌JCM 1126T以及巻曲乳杆菌JCM 1185T，而且前文描述的其它乳酸菌也可 适用，与现有的制造方法相比，可以得到具有更高的免疫功能调节活性的 乳酸菌。
IL-12促进未分化T细胞分化为Thl细胞，从而使Thl/Th2平衡向Thl 侧偏移(Cross ML, Gill HS, "Can immunoregulatory lactic acid bacteria be used as dietary supplements to limit allergies ", International Archives of Allergy and Immunology, 125, pp.ll2-119(2001))。由于向Th2侧偏移的Thl/Th2平衡诱 导抗原特异性IgE抗体的产生，所述IgE抗体是导致过敏反应发病的一个原 因，因此诱导自然免疫担任细胞产生IL-12、改善Thl/Th2平衡的活性在评 价菌株的过敏反应改善效果方面是一个重要指标。在本发明中，免疫功能 调节活性包括IL-12产生促进效果。
本发明的免疫功能调节剂可以单独给药或者与药品或食品中通常使用的其它成分混合后给药、或者通过与其它具有抗过敏反应活性的化合物或 微生物等并用，从而在对人和动物的过敏反应预防以及过敏反应症状的减 轻(治疗)中是有效的。可以用于过敏反应预防和/或治疗中。已经明确了
Thl/Th2平衡偏向Th2侧是特应性皮炎或过敏性鼻炎等过敏疾病的原因之 —(Hopkin, JM, "The rise of atopy and links to infection.", Allergy, 57 suppl 72, pp.5-9(2002)，以及Prescott, SL， Macaubas C， Smallacombe T， Holt BJ, Sly PD， Holt PG, "Development of allergen-specific T-cell memory in atopic and normal children. Lancet 353(9148), pp.l96-200(1999)，以及Shirakawa， T， Enomoto T, Shimizu S, Hopkin JM， "The inverse association between tuberculin responses and atopic disorder.", Science, 275(5296)， pp.77-79(1997))。本发明 的制造方法中包括的培养方法具有进一步提高乳酸菌的IL-12的产生能力 的效果。IL-12由树突状细胞产生、并具有向Thl细胞分化的功能，因此可 期待如此得到的乳酸菌具有高的免疫功能调节效果，可作为免疫功能调节 剂适用。过敏反应的种类没有特别限定，例如可列举出花粉症、特应性皮 炎、支气管哮喘、过敏性结膜炎、过敏性鼻炎、过敏性胃肠炎、过敏性反 应、药物过敏反应、荨麻疹、血清病、溶血性贫血、接触性皮炎、重症肌 无力症、古德帕斯彻综合症(Goodpasture's syndrome,也称为肺出血-肾炎 综合症)、肾小球肾炎(glomerulonephritis)等。过敏反应原也没有特别限 定，例如可列举出食品(小麦、大麦、燕麦、黑麦、荞麦、鸡蛋、牛奶、 奶酪、花生、米、玉米、小米、黍、稗、大豆、马铃薯、山药、大蒜、洋葱、 胡萝卜、欧芹、旱芹、番茄、橙子、桃子、苹果、猕猴桃、瓜、草莓、香 蕉、核桃、芝麻、蘑菇、鲍鱼、鱿鱼、咸鲑鱼子、虫下、蟹、鲑鱼、鲭鱼、 金枪鱼、沙丁鱼、鳕鱼、乌贼、章鱼、扇贝、牛肉、鸡肉、猪肉、明胶等)、 动物(狗、猫、小鼠、大鼠、鸪子等或其皮肤、体毛、粪便、羽毛等)、昆 虫(蛾、摇蚊、大黄蜂等和这些昆虫的分泌物、鳞粉)、螨虫、寄生虫(异 尖线虫、蛔虫等)、草木(杉树、柏树、豚草、禾本科植物、艾蒿、漆树、 赤杨等或这些草木的花粉、树液等)、霉菌、灰尘、室尘、橡胶、金属、化 学物质、药品等。
本发明的免疫功能调节剂在药品或饮料食品中的配合量根据形态、剂 型、症状、体重、用途等的不同而不同，因此没有特别限定，若要举例，
12可以以0.001~100% (w/w)的含量配合，优选以0.01 100% (w/w),更优 选以0.1 100% (w/w)的含量配合。
本发明的免疫功能调节剂的药品或饮料食品的每日摄取量根据年龄、 症状、体重、用途等的不同而不同，因此没有特别限定，若要举例，可以 摄取0.1~10000mg/kg体重，优选摄取0.1~1000mg/kg体重，更优选摄取 0.1~300mg/kg体重。
本发明的免疫功能调节剂可以以药品或饮料食品中的任一种形态利 用。例如，作为药品通过直接给药，或者作为特定保健用食品等特别用途 食品或营养功能食品通过直接摄取，可以期待预防和/或治疗各种过敏反应。 另外，不论是液体、糊状物、固体、粉末等形态，均可以添加到各种食品 (牛奶、加工奶、乳饮料、清凉饮料、发酵乳、酸奶酪、奶酪、面包、饼 干、薄脆饼干、比萨、冰淇淋、糖果、调制奶粉、流体食物、患者用食品、 幼儿用奶粉等食品、哺乳期妇女用奶粉等食品、营养食品、冷冻食品、加 工食品的其它市售食品等)中将其摄取。
可以在含有本发明的免疫功能调节剂的食品中混合水、蛋白质、糖质、 脂质、维生素类、矿物质类、有机酸、有机碱、果汁、香料类等使用。作 为蛋白质，例如可列举出全脂奶粉、脱脂奶粉、部分脱脂奶粉、酪蛋白、
乳清粉、乳清蛋白质、乳清蛋白质浓縮物、乳清蛋白质分离物、0L-酪蛋白、 P-酪蛋白、ic-酪蛋白、p-乳球蛋白、0t-乳清蛋白、乳铁蛋白、大豆蛋白质、 鸡蛋蛋白质、肉蛋白质等动植物性蛋白质、它们的水解物；黄油、乳清矿 物质、奶油、乳清、非蛋白质态氮、唾液酸、磷脂、乳糖等各种乳来源成 分等。可以含有酪蛋白磷酸肽、精氨酸、赖氨酸等肽或者氨基酸。作为糖 类，可列举出糖类、加工淀粉(除糊精之外、还有可溶性淀粉、英国淀粉 (British starch)、氧化淀粉、淀粉酯、淀粉醚等)、食物纤维等。作为脂质， 例如可列举出猪油、鱼油等、它们的分离油、氢化油、酯交换油等动物性 油脂；棕榈油、红花油、玉米油、菜籽油、椰子油、它们的分离油、氢化 油、酯交换油等植物性油脂等。作为维生素类，例如可列举出维生素A、 胡萝卜素类、维生素B族、维生素C、维生素D族、维生素E、维生素K 族、维生素P、维生素Q、尼克酸、烟酸、泛酸、生物素、肌醇、胆碱、叶 酸等。作为矿物质类，，例如可列举出钙、钾、镁、钠、铜、铁、锰、锌、硒等。作为有机酸，例如可列举出苹果酸、柠檬酸、乳酸、酒石酸等。在 制造含有本发明的免疫功能调节剂的饮料食品时，这些成分可以是合成品 或者天然物来源品的任一种，或者可以将大量含有这些成分的食品作为原 材料使用。这些成分可以组合2种以上使用。作为食品的形态，可以是固 体的或者液态。另外，也可以是凝胶状等。
将本发明的免疫功能调节剂作为药品使用时，可以以各种形态给药。 作为其形态，例如可列举出通过片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、糖浆剂、 液态剂等方式经口给药，但也可以是经管路给药等其它形态。这些各种剂 型可以按照常用方法在主剂中使用赋形剂、结合剂、崩解剂、润滑剂、除 臭剂、溶解辅助剂、混悬剂、包衣剂等在医药制剂技术领域中经常使用的 已知辅助剂来进行制剂化而得到。另外，可以含有适量的转。可以进一步 添加适当量的维生素、矿物质、有机酸、糖类、氨基酸、肽类等其它成分。
另外，在本说明书中引用的全部现有技术文献作为参考编入本说明书中。
实施例
以下，列举出实施例说明本发明，但本发明并不受这些实施例的限定。(培养时间对IL-12产生促进效果的影响的研究试验) 通过以下的试验对L. gasseri OLL2809的培养时间对IL-12产生促进效 果的影响进行了研究。
(乳酸菌的培养以及冻干菌粉末的制备) 将L. gasseri OLL2809置入Lactobacilli MRS Broth (以下也称为MRS 培养基，Becton Dickinson)中活化培养(37°C、 18小曰寸)2次。在MRS 培养基中以1%接种经活化的菌体，在37"C下静置培养。培养开始后，每隔 一定时间(0、 3、 6、 9、 12、 18、 24、 30小时后)对培养液进行取样。测 定各时间的培养液的OD,作为乳酸菌数的指标。另外，通过离心分离对各 时间(除了 0、 3、 9小时后)的培养液进行集菌，然后用生理盐水洗涤2 次、用灭菌蒸馏水洗涤l次。在培养和集菌、洗菌后，将各菌在75'C下加 热60分钟进行灭菌并冷冻干燥。将冻干菌粉末(以下也称为乳酸菌冻干粉 末)用于以下的在体外的IL-12产生促进效果试验中。
14(IL-12产生促进效果试验)
宰杀6 10周龄的雄性BALB/c小鼠(在各实验中n=3、日本SLC)并 取出脾脏。将去除了红细胞的脾细胞混悬在添加有10。/。(vol/vol)胎牛血清
(Intergen)、 100U/mL青霉素G ( 一 乂匕°卜口 -工)、100吗/mL链霉素( 乂t。卜口-工y)、2mML-谷氨酸(一 乂匕°卜口^工y)、 lmM丙酮酸钠(^f 乂匕。卜口"工y)、 O.lmM非必须氨基酸混合液(,y匕。卜口P工/)、 0.05mM2-巯基乙醇(NACALAI TESQUE)的RPMI1640培养基(O匕。
卜口^工y)中，使之达到2.5xl06/1111，在lpg/mL的乳酸菌冻干粉末存在 下，在5%浓度的C02孵育箱中培养2天。利用ELISA法(BDOptEIA ELISA套剂、Becton Dickinson)测定培养液上清的IL-12(p70)(pg/mL)，并 用于IL-12产生促进效果的评价。 (结果)
结果示于图1中。L. gasseri OLL2809的生长在培养6至12小时后呈对 数增殖，12小时后至30小时为OD66o未见变化的稳定状态。IL-12产生促 进效果到18小时后随着培养时间而增加，18小时后达到最高值，但即使延 迟培养时间至24小时、30小时也不降低。由该结果可知，在将L. gasseri OLL2809在MRS培养基中静置培养的情况下，IL-12产生促进效果因培养 时间不同而不同，即随着生长而增加，并在稳定期维持活性。(培养基的种类、成分对IL-12产生促进效果的影响的研究 试验)
为了研究IL-12产生促进效果是否因进行培养的培养基的不同而不同， 如下试验所示对在各种培养基或向培养基中添加了营养成分的培养基中培 养的L. gasseri OLL2809的IL-12产生促进效果进行了比较。
(乳酸菌的培养、冻干菌粉末的制备以及IL-12产生促进效果试验)
将在MRS培养基中经活化培养(37°C、 18小时)2次的L. gasseri OLL2809以1X接种到MRS培养基或GAM培养基(日水制药)，然后在 37。C下静置培养18小时。培养开始后，每隔一定时间(0、 3、 6、 9、 12、 18小时后)对培养液进行取样，测定各时间的培养液的OD自作为乳酸菌 数的指标。另外，对于培养18小时后的培养液，在检测pH的同时，使用与实施例1同样的方法制备乳酸菌冻干粉末，测定来自小鼠脾细胞的IL-12 的产生促进效果。 (结果)
结果示于图2中。在GAM培养基中培养的菌体(图2B中的GAM) 显示出比在MRS培养基中培养的菌体(图2B中的MRS)显著(p<0.05) 低的活性。因此，对于这些培养基成分的差异进行了种种研究(数据未显 示)，结果清楚了是因为GAM培养基的葡萄糖浓度较低(MRS培养基含有 终浓度为20g/L的葡萄糖，而GAM培养基含有终浓度为3g/L的葡萄糖)。
因此，在向GAM培养基中以各种浓度(终浓度为5、 10、 20g/L)添 加了葡萄糖的培养基中，进行L.gasseriOLL2809的培养，然后使用与实施 例1同样的方法对得到的菌体进行处理(集菌、洗涤、灭菌、冷冻干燥)， 然后进行来自小鼠脾细胞的IL-12的产生促进效果试验。结果示于图2B中 的GAM+葡萄糖。当向GAM培养基中添加葡萄糖时，葡萄糖的终浓度依 赖性地增加生长以及IL-12产生促进效果(图2A)，在葡萄糖的终浓度为 20g/L的GAM培养基中培养的菌体比在通常的GAM培养基(图2B中的 GAM)中培养的菌体活性显著地(p<0.05)增加。
针对葡萄糖添加对L. gasseri OLL2809的活性产生怎样的影响进行了研 究，结果注意到了培养液的pH对活性的影响。S口，在GAM培养基中由于 葡萄糖的终浓度低，因此与MRS培养基相比，生长恶劣，另外，由于来自 L. gasseri OLL2809的乳酸的生成量低，18小时后MRS培养基的培养液pH 为4.0，与此相对，在GAM培养基中为5.5。向GAM培养基添加葡萄糖， 在葡萄糖的终浓度为3 (未添加)、5、 10以及20g/L的培养基中，伴随着菌 的生长以及乳酸生成量的增加，培养18小时后的培养液的pH分别降低至 5.5、 4.8、 4.4禾卩4.3。因此，对在GAM培养基中培养L. gasseri OLL2809 18 小时时的培养液pH和菌体的IL-12产生促进效果的相关关系进行了分析， 结果确认了在该pH范围内二者之间具有显著的(p<0.05)负相关关系(图 2C， y=-987.01x+5696.7， n=4)。另一方面，确认了葡萄糖的终浓度与菌体 的IL-12产生促进效果之间没有这样的相关关系。上述结果启示培养液的 pH对菌体的IL-12产生促进效果具有影响。[实施例3](培养液的pH对IL-12产生促进效果的影响的研究试验) 为了详细研究培养液的pH对L. gasseri OLL2809的活性的影响，通过 以下试验对通过中和培养培养的L. gasseri OLL2809的IL-12产生促进效果 的随时间的变化进行了评价。
(乳酸菌的培养、冻干菌粉末的制备以及IL-12产生促进效果试验) 使用2L的发酵罐，在装入培养基量为1.5L、搅拌速度为200rpm/min、 利用氮气进行上面通气、培养温度为37'C的条件下，在MRS培养基(初始 pH约为6.4)中对L. gasseri OLL2809进行培养。使用pH调节器将pH设 定为4、 5或者6，按照不使其降到设定值以下的方式用10%(wt/wt)碳酸 钾溶液进行中和培养。使用与实施例1同样的方法对培养开始6、 12、 18 小时后的L. gasseri OLL2809培养液进行处理(集菌、洗涤、灭菌、冷冻干 燥)，得到冻干菌粉末，并对其通过与实施例1同样的方法对IL-12产生促 进效果进行研究。另外，对培养开始3、 6、 9、 12、 15、 18小时后的培养 液进行活菌数和pH的测定。 (结果)
结果示于图3中。活菌数与培养液的设定pH无关并以基本相同的倾向 推移，从培养开始12小时以后在任一设定pH下均达到稳定期。最终，设 定pH为6的活菌数约为设定pH为5或4的一半(图3A)。另一方面，培 养液的pH从培养开始在6小时后在设定为4和5的培养液中没有差异，但 在12小时以后任一培养液均大致接近设定的pH (图3B)。
IL-12产生促进效果从培养开始在6小时后没有发现因培养液的设定 pH不同而有差别，任一个均显示较低的数值，但在培养12小时以后设定 pH越偏向酸性侧的培养组显示了越高的数值(图3C)。另一方面，在设定 pH为6中进行培养时，与培养期无关，无论任何时间均显示较低的IL-12 产生促进效果。从上述结果可知，L. gasseri OLL2809的IL-12产生促进效 果因培养液的pH不同而不同。由此可知，对于IL-12产生促进效果，培养 液的pH是很重要的。(培养液的pH对其它乳酸菌的IL-12产生促进效果的影响 的研究试验)
17通过以下试验针对培养液的pH是否影响L. gasseri OLL2809以外的乳 酸菌的IL-12产生促进效果进行了研究。
(乳酸菌培养、冻干菌粉末的制备以及IL-12产生促进效果试验)
将经活化培养(37。C、18小时)的L. amylovorus JCM 11267和1^. crispatus JCM 1185T以1%接种到MRS培养基(CaC03为0%)或接种到添加有作为 缓冲剂的0.6%的CaC03的MRS培养基(CaC03为0.6%)中，在37°。下培 养18小时。使用与实施例1同样的方法对培养液进行处理(集菌、洗涤、 灭菌、冷冻干燥)，然后测定来自小鼠脾细胞的IL-12的产生促进效果。在 主培养中，为了防止CaC03沉淀， 一边用磁力转子以70rpm/min的旋转速 度搅拌， 一边培养。
其中，这些菌株名中记载为JCM的菌株是从独立行政法人理化学研究 所生物资源中心的微生物材料开发室获得的标准株。 (结果)
结果示于图4中。与单纯MRS培养基的情况相比，在以0.6%的浓度 添加了 CaC03的MRS培养基中，L. amylovorus JCM 11267和1^. crispatus JCM1185T在培养18小时后，培养液pH分别向中性侧缓冲从3.8(CaCCb 为0%)到4.5 (CaC。3为0.6%)、从3.9 (CaCO3为00/。)到4.5 (CaC03为 0.6%)，活菌数分别从1.3xl09cfu/mL (CaC03为0%)增加到2.3x109cfu/mL (CaC03为0.6%)、从7.3xl07cfu/mL (CaC03为0%)增加到1.6xl08cfb/mL (CaC03为0.6%)。但是丄.amylovorus JCM 1126丁禾口 L. crispatus JCM 1185T 的IL-12产生促进效果都因CaC03添加而显著地(p<0.05)降低。从该结果 可知，培养液的pH影响IL-12产生促进效果的现象在L. gasseri OLL2809 和在其它乳酸菌是共通的。(培养液pH对IL-12产生促进效果的影响的研究试验) 为了弄清楚因培养液的pH不同而L. gasseri OLL2809的IL-12产生促 进效果不同的原因，通过在MRS培养基中静置培养18小时来制备IL-12 产生促进效果高的菌体，进而对其进行加热处理或在非加热后，在pH不同 i勺缓冲液中、37。C下放置6小时，之后比较IL-12产生促进效果。 (乳酸菌的培养、样品的制备以及IL-12产生促进效果试验)使用与实施例1同样的方法对在MRS培养基中、37i:下培养18小时 而得到的L. gasseri OLL2809进行集菌，洗涤，然后不加热地进行冷冻干燥。 将非加热的冻干菌粉末按照4mg/mL的方式混悬在蒸馏水中，然后将该菌 体悬浮液用含有4mM的MgCl2的20mM的枸橼酸缓冲液(pH为4、 5、 6) 稀释为1:1，制备成菌体悬浮液(2mg/mL)。将各菌体悬浮液取半量在75°C 下加热处理60分钟(加热处理样品heated),剩余半量保持非加热状态(非 加热样品unheated)。接着，将各样品在37'C下室温放置6小时。对照使 用将在MRS培养基中、37。C下培养18小时后得到的L. gasseri OLL2809按 照与实施例1同样的方法进行集菌、洗涤、灭菌后经冻结干燥的冻干菌粉 末。对各样品使用与实施例1同样的方法测定来自小鼠脾细胞的IL-12的产 生促进效果。
结果示于图5中。在加热处理后放置的情况下，无论pH如何，与对照 相比没有差异。在非加热的情况下，与对照相比，放置在中性范围的pH下 的菌体的IL-12产生促进效果降低。从该结果可知，L. gasseri OLL2809的 IL-12产生促进效果在中性范围的pH下减少，但至少在pH为4下稳定6 小时。另外，该结果与到目前为止在各种条件下的L.gasseriOLL2809的培 养中，若培养液的pH在约5以上则IL-12产生促进效果降低的结果是一致 的，认为其是由于在中性范围的pH下有效成分发生了分解(或是阻碍了生 物合成)。该IL-12产生促进效果的降低启示与酶等高敏感性物质相关。
由于能够得到免疫调节活性高的乳酸菌，因此可将其用于制造具有免 疫调节活性的饮料食品或者药品。
权利要求
1. 一种含有乳酸菌的免疫功能调节剂的制造方法，其包括在pH3.5～pH 5.0的培养基中对乳酸菌进行培养的工序。
2. 如权利要求1所述的免疫功能调节剂的制造方法，其中，所述乳酸 菌为具有IL-12产生促进效果的乳酸菌。
3. 如权利要求1或2所述的免疫功能调节剂的制造方法，其中，所述 乳酸菌为乳杆菌属乳酸菌。
4. 如权利要求1 3任一项所述的免疫功能调节剂的制造方法，其中， 所述乳酸菌为选自格氏乳酸杆菌OLL2809菌株(Lactobacillus gasseri OLL2809，保藏号为NITEBP-72)、嗜淀粉乳杆菌JCM 1126T以及巻曲乳杆 菌JCM 11857中的至少一种乳酸菌。
5. —种免疫功能调节剂，其是通过权利要求1 4任一项所述的制造方 法制造的。
6. —种过敏反应预防和/或治疗用饮料食品，其含有权利要求5所述的 免疫功能调节剂。
7. —种过敏反应预防和/或治疗用药品，其含有权利要求5所述的免疫 功能调节剂。
8. —种权利要求5所述的免疫功能调节剂的用于制造过敏反应预防和 /或治疗用药品或者过敏反应预防和/或治疗用饮料食品的用途。
全文摘要
本发明提供一种免疫调节活性高的乳酸菌的培养法。本发明针对乳酸菌的培养条件对来自小鼠脾细胞的IL-12的产生促进效果的影响进行了锐意研究。其结果发现作为与上述乳酸菌的免疫功能调节活性有关的因子，培养液的pH特别地有较大相关，从而完成了本发明。
文档编号C12N1/20GK101454439SQ20078001971
公开日2009年6月10日 申请日期2007年5月25日 优先权日2006年5月31日
发明者古市圭介, 指原纪宏 申请人:明治乳业株式会社