专利名称：细胞保护剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及细胞保护剂，更具体地说，本发明涉及以属于嗜热链球菌的乳酸菌的培养上清中的低分子级分作为有效成分的细胞保护剂。
背景技术：
已有报告指出，在乳酸菌的培养上清中、即将乳酸菌接种在主要以乳为主成分的培养基中而得到的培养物中，含有具有作为皮肤外用剂的效果的成分。例如据报告乳酸菌的培养上清具有抗氧化作用及光防护作用(专利文献1、非专利文献I和2)。另外还已知其有皱纹形成抑制作用(专利文献2)，进一步地，还已知在乳酸菌提取物中存在具有细胞增殖作用的成分(专利文献3)。但是，乳酸菌的种类很多，因此可预测其培养上清中所含有的有效成分也呈多样化，并且，将其作为化妆料或外用剂的有效成分进行利用时，由于根据目的选择活性特别高的部分来进行利用是有利的，因而需要对于乳酸菌的培养上清及乳酸菌提取物进一步进行研究，检测出具有更为优异效果的成分。现有技术文献专利文献 专利文献1:日本特开昭58-198584专利文献2:TO2008/026318专利文献3:日本专利第3172599非专利文献非专利文献1:日本香妆品科学会第7次学术学会讲演要旨，59，1982
非专利文献2:日本香妆品科学会第8次学术学会讲演要旨，210，198
发明内容
发明所要解决的课题因而，本发明的课题在于从乳酸菌的培养上清中发现新颖且有用的成分，并提供该成分的有效利用方法。解决课题的手段本发明人对于各种乳酸菌的培养上清中所含有的有效成分进行了研究，结果发现，在属于嗜热链球菌的乳酸菌的培养上清的低分子级分中存在具有优异的细胞保护效果的物质，从而完成了本发明。S卩，本发明提供一种细胞保护剂，其中，该细胞保护剂以属于嗜热链球菌的乳酸菌的培养上清中的低分子级分作为有效成分。本发明还提供皮肤外用剂，其含有上述细胞保护剂。本发明进一步提供皮肤细胞的保护方法，其特征在于，将属于嗜热链球菌的乳酸菌的培养上清中的低分子级分应用在想要保护的皮肤上。
发明的效果利用本发明的细胞保护剂，即使在皮肤等的细胞暴露于羟基自由基等的情况下，也能够由其对细胞进行保护，也不会引起细胞数减少以及随之出现的细胞过度增殖，能够防止皮肤肥厚、皮肤炎症、皮肤干燥、干燥所致的皱纹形成、弹性降低、以及色素斑的产生及恶化。
图1为示出实施例1中得到的透析液的HPLC结果的附图。图中，a表示分子量为
10,OOODa的位置、b表不分子量为342Da的位置、c表不分子量为180Da的位置。图2为示出实施例2中得到的透析液的HPLC结果的附图。图中a、b和c与上述相同。
具体实施例方式乳酸菌培养上清的低分子级分是本发明的细胞保护剂的有效成分，其是如下得到的:在培养基中对属于嗜热链球菌的乳酸菌进行培养，由所得到的培养物中除去固体物质，从而制造出乳酸菌培养上清，进一步对该乳酸菌培养上清进行超滤等，采集分子量为20，OOODa以下的级分，由此得到所述低分子级分。作为此处所使用的属于嗜热链球菌的乳酸菌，可以举出嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)YIT2001 株(FERM BP-7538，保藏日:2001 年 I 月 31 日)、嗜热链球菌(Sti^ptococcus thermophilus)YIT2084 株(FERM BP-10879，保藏日:2006 年 8月18日)等，它们可以单独使用或以2种以上进行使用。需要说明的是，这些属于嗜热链球菌的乳酸菌株被保藏在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(日本国茨城县筑波市东I 丁目I番地I中央第6 (邮政编码305-8566))。作为对该属于嗜热链球菌的乳酸菌进行培养的培养基，可以举出下述物质作为适当的培养基:人乳、牛乳、山羊乳等动物乳；脱脂乳；来自奶粉或脱脂奶粉的还原乳；奶油等乳制品，并且也可以使用豆乳等大豆加工品，但优选以乳为主成分的培养基。另外，这些物质可直接作为培养基使用，也可根据需要稀释成适当浓度进行使用。进一步地，也可在这些培养基中另外配合在乳酸菌培养中出于补充营养源的目的而通常使用的成分。作为这样的成分，可以举出:酵母浸膏；绿藻萃取物；维生素A、维生素B族、维生素C、维生素E等维生素类；包含各种肽类的蛋白分解物；氨基酸类；钙、镁等盐类。使用上述培养基的属于嗜热链球菌的乳酸菌的培养可按常规方法进行，作为该培养的一例，可以举出培养温度为30°C 45°C、更优选为37°C 42°C，培养时间为I小时 48小时、更优选为4小时 24小时。另外，作为此时的其它培养条件，可以举出静置、搅拌、振荡、通气等，可由这些条件中适当选择适于培养的方法。用于本发明的乳酸菌的培养上清是通过按照过滤、离心分离等常规方法由如上得到的乳酸菌培养物中除去固体物质而得到的。另外，乳酸菌的培养上清的低分子级分可以通过利用超滤或凝胶过滤等常规方法从乳酸菌的培养上清中除去分子量大于20，OOODa的成分来得到。对于如此得到的本发明的细胞保护剂，通过在细胞暴露于过氧化氢等损伤物质之前或曝露过程中将该保护剂加入到细胞中，可以抑制暴露于损伤物质中所致的细胞数降低，但若在暴露于损伤物质之前添加，则可有效预防细胞数降低，因而优选在暴露于损伤物质之前将该保护剂加入到细胞中。另外，上述细胞保护效果的详细机理尚不明确，但由于在暴露于损伤物质时即使在本发明的细胞保护剂并未与细胞共存的情况下也可发挥出其效果，因而认为，利用本发明的细胞保护剂对细胞本身赋予针对损伤的耐性这一点也是机理之一。对上述损伤物质并无特别限制，可以举出羟基自由基、过氧化氢、单线态氧、过氧化物等活性氧。另外，下述各种会诱发细胞数降低的损伤要因也包含在损伤物质中:紫外线、放射线或诱变性物质等中的曝露；紧张压力、吸烟等。另外，对于作为本发明细胞保护剂的对象的细胞，只要为可能会暴露于损伤物质中的生物体细胞就没有特别限制，可以举出例如表皮细胞、树状细胞、成纤维细胞、肥大细胞、原生质细胞、朗格汉斯细胞、血管内皮细胞等。其中可适用于皮肤细胞、特别是成纤维细胞。另外，作为本发明中所用的属于嗜热链球菌的乳酸菌的示例，如上所述为嗜热链球菌YIT2001株和嗜热链球菌YIT2084株，它们与前述专利文献2中为了得到具有皱纹形成抑制作用的培养上清而使用的菌株是相同的。但是，专利文献2中所用的培养上清是通过在乳酸菌培养后加入三氯乙酸(TCA)进行沉淀、进一步加入乙醇而得到的。然后，通过进行TCA沉淀使蛋白质除去，进一步通过乙醇提取主要得到多糖类、且使低分子成分除去，因而专利文献2的培养上清是不含有蛋白质且平均分子量为90万左右的多糖类。与此相对，本申请发明的属于嗜热链球菌的乳酸菌的培养上清的低分子级分(下文称为“培养上清低分子级分”)中，如后所述，由于并未进行TCA沉淀，因而其中存在有蛋白质，并且由于采集分子量为20，OOODa以下的级分，因而可知其为低分子级分，在构成成分及其分子量方面与专利文献2是不同的。本发明的细胞保护剂以上述培养上清低分子级分作为有效成分，作为所使用的培养上清低分子级分，可以从乳酸菌的培养上清中除去分子量超过20，OOODa的部分，对其进行直接使用、或将其制成浓缩或稀释的液态物进行使用，或者通过喷雾干燥或冷冻干燥等手段对其进行干燥，以粉末状物的形式进行使用。此外，对于本发明的细胞保护剂来说，可以将其配合在化妆品、药品、准药品(quasidrug)等皮肤外用剂组合物中。该皮肤外用剂组合物的制造可以按照常规方法进行，例如，可将本发明的细胞保护剂按照可发挥出所期望的作用效果的程度适量溶解或者分散在纯净水、化妆水基剂、乳霜基剂、乳液基剂等中。作为更具体的皮肤外用剂组合物的示例，可以举出:化妆水、乳液、各种乳霜、面膜、美容液等基础化妆料；香波、润发素、护发素、养发素、整发液、护发霜、护发乳等头发用制品；沐浴露等浴用化妆品；粉底、口红、睫毛膏、眼影等化妆用化妆品；防晒霜等。
对作为细胞保护剂的培养上清低分子级分在这些皮肤外用剂组合物中的混合量并无特别限定，可以根据所使用的细胞保护剂的剂型或用途来确定，在直接使用培养上清低分子级分的情况下，优选为0.01质量％ 100质量％、特别优选为0.1质量％ 90质量％左右、进一步优选为I质量％ 20质量％。另外，在对培养上清低分子级分进行干燥来使用的情况下，其混合量为0.0Ol质量％ 10质量％、特别优选为0.01质量％ 9质量％、进一步优选为0.1质量％ 2质量％。另外，在上述皮肤外用剂组合物中，除了作为必要成分的本发明的细胞保护剂之夕卜，还可配合通常配合在皮肤外用剂中的任意成分。作为这样的任意成分，可以举出:表面活性剂、油分、醇类、保湿剂、增稠剂、防腐剂、抗氧化剂、螯合剂、PH调节剂、香料、色素、紫外线吸收 散射剂、粉体、维生素类、氨基酸类、水溶性高分子、发泡剂、颜料、植物提取物、动物来源成分、海藻提取物、各种药剂、添加剂、水等。此外，由于本发明的细胞保护剂以具有食用历史的乳酸菌的培养上清低分子级分作为有效成分，因而还可进一步配合在各种饮食品中。例如，可以在上述培养上清低分子级分中添加适当的助剂，之后采用惯用的手段成形为适于食用的形态，例如成形为颗粒状、粒状、片剂、胶囊、糊剂等以供食用，并且可添加在各种食品中进行使用，所述食品例如为:火腿、香肠等食肉加工食品；鱼糕、圆筒状鱼糕等水产加工食品；面包、糖果点心；等等，或者可添加在水、果汁、牛奶、冷饮等饮料中进行使用。实施例接下来举出实施例更详细地说明本发明，但本发明并不受这些实施例的任何限制。实施例1将保存在_80°C的嗜热链球菌 Τ2084菌株以I接种环的量接种在2mL试验管中的MRS培养基(Difco)中，在40°C静置培养一夜。接着将该培养物接种在2mL的10%脱脂奶粉水溶液(10%脱脂乳(Difco))中，使其浓度为1%，之后在40°C静置培养一夜，作为第一次前培养。进一步同样地进行第二次前培养，将该第二次前培养物按1%接种在主培养培养基(3%脱脂奶粉水溶液)IOOmL中，在40°C进行24小时静置培养。在4°C、8，000 X g的条件下对培养后的菌液进行15分钟离心分离，除去沉淀物。使用Centricut Mini V_20(截留分子量20，OOODa ;仓敷纺织)，在4°C、3000 X g的条件下对所得到的沉淀物去除液进行I小时超滤，得到IOmL透过液I。对于所得到的透过液I进行冷冻干燥，将其溶解在50mM NaCl中后，在下述条件下进行HPLC。其结果见图1。由HPLC结果可知，上述透过液I的平均分子量为300Da。[HPLC 条件]装置:Waters_600E检测器:ISIR1-980柱:ShodexSUGAR KS-804柱温度:80°C移动相:50mMNaCl流速:ImL/分钟注入量:10μ L
实施例2除了将嗜热链球菌 Τ2084替换为嗜热链球菌 Τ2001以外，与实施例1同样地得到IOmL的透过液2。
对于该透过液2，也与实施例1同样地进行HPLC，得到图2的结果。可知该透过液2的平均分子量为300Da。实施例3利用过氧化氢进行的细胞的曝露试验:将小鼠皮肤来源成纤维细胞3T3以每孔1.3 X IO4个播种在96孔培养板中，在含有10%FBS的D-MEM培养基中、在5%C02气氛下、在37°C进行24小时培养。培养后，除去培养基，利用PBS进行2次清洗，之后交换为D-MEM培养基(100 μ L)。将透过液I和透过液2、以及使用PBS分别对其进行2倍稀释后所得的液体各IOyL添加到培养板的孔中，在5%C02气氛下、在37°C进行24小时培养。对于上述透过液，直接使用从乳酸菌的培养上清中除去分子量超过20，OOODa的部分所得到的液体。再次除去培养基，利用PBS进行2次清洗，之后添加H2O2和FeSO4使其最终浓度分别为40(^11和5 4 11，在5%0)2气氛下、在37°C进行6小时培养。另外，对于非曝露组，在仅添加PBS后在相同条件下进行培养。最后，使用结晶紫对细胞进行染色，以590nm的吸光度作为活细胞数的指标。另夕卜，作为对照，不使用透过液，仅利用PBS。其结果列于表I。表I
权利要求
1.一种细胞保护剂，其以属于嗜热链球菌的乳酸菌的培养上清中的低分子级分作为有效成分。
2.如权利要求1所述的细胞保护剂，其中，低分子级分是通过对乳酸菌培养上清进行超滤或凝胶过滤而得到的。
3.如权利要求1或2所述的细胞保护剂，其中，低分子级分的分子量为20，OOODa以下。
4.如权利要求1至3的任意一项所述的细胞保护剂，其中，属于嗜热链球菌的乳酸菌是保藏号为FERM BP-7538的嗜热链球菌YIT2001株、或保藏号为FERMBP-10879的嗜热链球菌 Τ2084 株。
5.如权利要求1至4的任意一项所述的细胞保护剂，其中，该细胞保护剂抑制细胞暴露于损伤物质时的细胞数降低。
6.如权利要求5所述的细胞保护剂，其中，损伤物质为活性氧。
7.如权利要求5所述的细胞保护剂，其中，损伤物质为羟基自由基。
8.一种皮肤外用剂，其含有权利要求1至7的任意一项所述的细胞保护剂。
9.如权利要求8所述的皮肤外用剂，其中，该皮肤外用剂为化妆品。
10.一种皮肤细胞的保护方法，其特征在于，将属于嗜热链球菌的乳酸菌的培养上清中的低分子级分应用在想要保护的皮肤上。
11.如权利要求10所述的皮肤细胞的保护方法，其特征在于，该方法抑制暴露于损伤物质时的细胞数降低。
12.属于嗜热链球菌的乳酸菌的`培养上清中的低分子级分在用于制造细胞保护剂中的应用。
全文摘要
本发明的目的在于从乳酸菌的培养上清中发现新颖且有用的成分，并提供该成分的有效利用方法。该利用方法为一种细胞保护剂，所述细胞保护剂以属于嗜热链球菌的乳酸菌的培养上清中的低分子级分作为有效成分。
文档编号A61Q19/00GK103118687SQ20118003368
公开日2013年5月22日 申请日期2011年8月12日 优先权日2010年8月27日
发明者伊藤直树, 仓泽智子, 曾根俊郎, 千叶胜由 申请人:株式会社益力多本社