通过天然感受态转化属于链球菌属的细菌的方法

专利名称：通过天然感受态转化属于链球菌属的细菌的方法
技术领域：
本发明涉及通过天然感受态(competence)转化属于链球菌属(Str印tococcus genus)的细菌的方法。
背景技术：
嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)广泛用于制造酸乳酪(yoghurt)和瑞士型或意大利型干酪。这些产品具有每年大约四百亿美元的市场价值，从而使嗜热链球菌成为具有巨大市场重要性的物种。即使该细菌的发酵性质已经通过筛选和传统方法得到逐步改善，但仍然具有通过天然方法或通过遗传工程进一步改善的巨大潜能。为了能够不使用任何遗传工程技术而天然改善嗜热链球菌技术性能、生理性质，在不同培养基中的行为对于发酵食品和饲料业非常重要。所获得的嗜热链球菌改良株将完全顺从于与用于食品和饲料的活微生物相关的当前所有的调节。当前可利用的嗜热链球菌基因组序列的计算机(in silico)分析提示，通过横向基因转移获得许多基因(1)。如在使用感受态作为用于基因组可塑性的整体机制的病原性链球菌中所报道的，这些横向基因转移潜在地通过被称为感受态的天然转化而发生。感受态是细胞从其环境中摄取细胞外(“裸”)DNA并将该DNA (或其部分)整合在其基因组中的能力。感受态可以分为天然感受态和人工感受态。天然感受态是细菌菌株在遗传上具有执行该DNA摄取的特定能力。天然感受态被认为是在天然环境中自发发生，并且还在实验室环境中观察到天然感受态。天然感受态似乎是链球菌的共同特征0，3)。与之相比，人工感受态在实验室环境下激发并由使裸DNA能够瞬时透过细胞组成。因此，天然基因转化是通过天然感受态使给定细菌菌株能够被转化，即被修饰从而将多核苷酸整合至其基因组的过程。在肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)中对链球菌的天然感受态进行了最深入的研究，并且发现链球菌的天然感受态似乎是链球菌种的共同特征。感受态通常受到严格调节并且包括两组基因早期感受态基因和晚期感受态基因G)。在肺炎链球菌中，天然感受态是依赖于培养基中信息素(CSP)的积累的瞬时事件。早期感受态基因编码二组分系统(TCS =ComD和ComE)，其同族诱导因子(CSP =ComC)和旨在CSP输出和熟化的ABC转运子的组分(ComA和ComB)。CSP诱导时，TCS活化感受态σ因子ComX(oX)的转录。该选择性σ因子由于正调节DNA摄取、保护和整合至染色体所需的所有重要的晚期基因，而是天然感受态的核心调节子。参见图1的图示。在嗜热链球菌(S. thermophilus)基因组中发现了推定的comX基因和组装对嗜热链球菌天然感受态至关重要的所有晚期感受态基因的其他基因(1)。此外，计算机鉴定中公认为σ χ的推定“ComX-盒”在含有至关重要的晚期感受态基因的所有操纵子的上游。 用于天然感受态的所有至关重要基因在嗜热链球菌中的这种维持提示其在嗜热链球菌生态龛位中发挥重要的生理性功能(将DNA用作养分、基因组可塑性...)(1)。在2006年， Havarstein (5)小组通过使用遗传工程学方法发现天然感受态在嗜热链球菌LMG18311中的功能性。这通过使用包含在调节肽诱导的启动子控制下的comX的基于质粒的系统而得以实现(blp系统，(6))。显著地，利用全部基因组DNA或者线性dsDNA以与肺炎链球菌类似的效率实现了高转化率(10_3至10_2) (5)。值得注意的是，在这种情况下，通过ComX的遗传工程化诱导使晚期感受态基因的人工诱导成为可能。然而并且令人惊讶的是，通常发现于肺炎链球菌基因组中并且在天然感受态的诱导中发挥关键作用的早期感受态基因无一存在于嗜热链球菌基因组中。最近，证明嗜热链球菌LMD-9能够在在化学限定培养基中生长的过程中诱导感受态。在LMD-9菌株中，发现在这些条件下尤其需要转运子Ami用于 comX的转录诱导(7)。Ami系统主动将细胞外培养基中存在的寡肽输入并已知在革兰氏阳性菌中具有营养和信号转导的功能(7，8，9)。由于这种化学限定培养基是不含肽的培养基， Gardan等人(7)预言在这些生长条件下，细菌合成并分泌特定的感受态刺激肽，然后通过 Ami系统感受到该感受态刺激肽并再次输入。内化后，该现象然后与特定的胞质调节子相互作用，导致comX的转录诱导(模型可参见图2)。在化学限定培养基条件下负责comX表达和天然转化的信息素和转录调节子仍不可知。虽然化学限定培养基中的天然转化对于LMD-9菌株非常有效(10_4至10_3)， LMG18311菌株的转化率显著较低(10_7至10_6)。此外，在化学限定培养基中生长的 CNRZ1066菌株的情况下，可能检测不到转化子(转化率< 10_8) (7)。据发明人了解，目前没有不使用遗传工程而在嗜热链球菌的菌株中诱导天然感受态的成功报道。现有技术仍然需要在链球菌中、优选嗜热链球菌和/或唾液链球菌 (Streptococcus salivarius)中诱导天然感受态的方法，和使用全世界公认的非GMO技术转化所述细菌的方法。

发明内容
本发明人已经鉴定了新的疏水短肽aip316，其具有SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列，并且参与嗜热链球菌菌株的天然感受态。此外，本发明人还证明了该肽的片段能够在属于链球菌属的细菌中诱导天然感受态。aip316具有以下氨基酸序列MKTLKIFVLFSLLIAILPYFAGCL(SEQ ID NO :1)。因此，本发明涉及具有SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO 1具有至少75%的同一性的肽或者所述肽的片段，其中所述肽或其片段能够在嗜热链球菌菌株中诱导或提高感受态。通常，所述肽或其片段能够在编码SEQ ID NO 1的基因已被失活的嗜热链球菌菌株LMD-9中诱导或提高感受态。在本申请中，“本发明的肽”的表述涵盖具有氨基酸序列SEQ ID NO 1的肽、具有与SEQ ID NO 1具有某种相似性(至少75%的同一性)的氨基酸序列的肽和其片段(还称为“成熟”肽)。本发明的肽的实例公开在附文III中。在提及肽时，“能够在编码SEQ ID NO 1的基因已被失活的嗜热链球菌菌株LMD-9 中诱导或提高感受态”的表述是指能够在实验A中将转化率提高至少10倍，优选至少50 倍，至少100倍，甚至更优选至少1000倍的任何肽。按照实施例中和以下的描述进行测定肽诱导或提高感受态的能力的实验A
将shp316基因(编码肽Sip316的基因)已失活的LMD-9的突变株，例如LMD9- Δ blp: Pcomx-IuxAB Δ shp316: :P32-cat (该菌株的详细信息参见实施例2)在M17-乳糖培养基中预培养。收集预培养的细胞(5000g，9分钟，20°C)并在化学限定培养基(CDM，参见附文 I)中洗涤2次，然后重悬在CDM中。将洗涤后的细胞稀释在新鲜的CDM培养基中以获得在 600nm为0. 05的光密度，然后在37°C孵育。孵育1. 5小时后，将培养基分为2份试样，每份 IOmL,并将0或IOOOnM肽加入至所述培养样本中。最后，将IOmL的每个试样分成两个样本， 每个样本5mL。所述2个样本之一接受1 μ g/mL pGIUD0855ery (具有红霉素抗性基因的质粒)。通过进行实施例1所述的天然转化实验研究样本的感受态表型。培养培养物6小时并将系列稀释液铺在含有或不含2. 5 μ g/mL红霉素的M17-乳糖琼脂培养基的表面。针对每个样本计算存在或不存在所述肽时的转化率，并用总细菌群中的红霉素抗性细胞的比例表不。如果在所述肽存在下的转化率与不存在所述肽的转化率之比为至少10，优选至少 50，更优选至少100，甚至更优选至少1000，则认为所述肽已经诱导或提高了其中的shp316 基因已失活的LMD-9菌株的感受态。本发明的肽与SEQ ID NO :1可具有至少75%同一性，优选与SEQ ID NO 1具有至少79%同一性，更优选与SEQ ID NO :1具有至少83%同一性，甚至更优选与SEQ ID NO 1 具有至少87%同一性，甚至更优选与SEQ ID NO :1具有至少91%同一性，甚至更优选与SEQ ID NO :1具有至少95%同一性。 根据本发明的优选实施方式，本发明的肽的C-末端具有以下氨基酸序列AGCL或 TGCL0根据本发明的优选的实施方式，本发明的肽的C-末端具有以下氨基酸序列 PYFAGCL, LPYFAGCL、ILPYFAGCL、AILPYFAGCL 或 PYFTGCL。在特定的实施方式中，所述多肽具有以下氨基酸序列 MKTLKIFVLFSLLIPILPYFAGCL(SEQ ID NO :2)。该序列与SEQ ID NO :1具有高于95%的同一性。推定该肽来自嗜热链球菌菌株 CNCM 1-2423 的基因组，该菌株由 Rhodia Food SAS(B. P. 10，Ζ. A. de Buxieres,8622 ODange-Saint-Romain)于2000年4月5日保藏在法国微生物保藏中心(CNCM) (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes,28 rue du Docteur Roux,75724 Paris CEDEX 15，France)，保藏号为 CNCM 1-2423。在另一个具体的实施方式中，所述肽具有以下氨基酸序列MKKLKLFTLFSLLITILPYFTGCL(SEQ ID NO :3)。该序列与SEQ ID NO 1具有高于79 %的同一性，与SEQ ID NO :1具有高于 83%的相似性。推定该肽来自现有技术已知的菌株唾液链球菌菌株SK126(登录号NZ_ ACL001000018)的基因组。因此，在具体的实施方式中，本发明的肽可以与SEQ ID NO :1具有至少79%相似性，优选与SEQ ID NO 1具有至少83%相似性，更优选与SEQ ID NO 1具有至少87%相似性，甚至更优选与SEQ ID NO :1具有至少91%相似性，甚至更优选与SEQ ID N0:1具有至少95%相似性。通过使用基于化学相似性或氨基酸之间的进化距离的相似性打分矩阵测定两个氨基酸序列之间的相似性。通常使用的这种矩阵的实例为BL0SUM62矩阵(12)，其是BLAST 组程序的缺省矩阵。在具体的实施方式中，本发明的肽可以-与SEQID NO :1具有至少75%同一性，优选与SEQ ID NO :1具有至少79%同一性，更优选与SEQ ID NO :1具有至少83%同一性，甚至更优选与SEQ ID NO :1具有至少 87%同一性，甚至更优选与SEQ ID NO :1具有至少91%同一性，甚至更优选与SEQ ID NO: 1具有至少95%同一性。-与SEQID NO 1的第6- 位具有至少84%同一性，更优选与SEQ ID NO 1的第6- 位(对应于SEQ ID NO 4)具有至少89%同一性，甚至更优选与SEQ ID NO=I的第 6-24位(对应于SEQ ID NO 4)具有至少94%同一性。不期望受理论束缚，Shp316被认为是感受态诱导肽的前体；Shp316被熟化并以片段的形式(称为“成熟” Shp316)且以临界浓度被分泌在细胞外培养基中，所述“成熟” Shp316通过comX表达的活化而诱导感受态。寡肽转运子Ami在信号转导级联放大中的参与(7)以及Rgg调节子STER_0316(参见实施例1)的参与进一步表明，“成熟”》ιρ316 被重输送至细胞中以与STER_0316相互作用。这种相互作用然后将活化STER_0316，其反过来将直接或者不直接诱导comX转录(模型参见图5)。通常，本发明的肽可以包含至少7个氨基酸，优选至少6个氨基酸，甚至更优选至少5个氨基酸，甚至更优选至少4个氨基酸。因此，本发明的肽包含至多M个氨基酸，至多23个氨基酸，至多22个氨基酸，至多21个氨基酸，至多20个氨基酸，优选至多19个、至多18个、至多17个、至多16个、至多 15个、至多14个、至多13个、至多12个、至多11个、至多10个、至多9个氨基酸，甚至更优选至多8个、至多7个、至多6个、至多5个氨基酸或至多4个氨基酸。Shp316显示带正电荷的N-末端，疏水核心和短的C-末端序列(CL)。对应于氨基酸第 6-24 位的序列是序列IFVLFSLLIAILPYFAGCL(SEQ ID NO 4)。在一个实施方式中，本发明的肽具有SEQ ID NO :4所示的氨基酸序列。在另一个实施方式中，本发明的肽包含氨基酸序列AGCL或TGCL。在另一个实施方式中，本发明的肽包含氨基酸序列PYFAGCL、LPYFAGCL、 ILPYFAGCL、AILPYFAGCL 或 PYFTGCL。在一个实施方式中，本发明的肽包含来自SEQ ID NO :4所示的氨基酸序列的至少 7个，优选至少6个，甚至更优选至少5个，甚至更优选至少4个连续氨基酸。在具体的实施方式中，本发明的肽具有氨基酸序列PYFAGCL，其对应于SEQ ID NO: 1的第18-M位。推定该肽来自嗜热链球菌菌株LMD-9或菌株CNCM H423的基因组。在另一个具体的实施方式中，本发明的肽具有氨基酸序列PYFTGCL，其对应于SEQ ID N0:3的第18- 位。推定该肽来自现有技术已知的唾液链球菌菌株SK126(登录号NZ_ ACL001000018)的基因组。在一个实施方式中，本发明的肽具有选自附文III中公开的序列的氨基酸序列。—方面，本发明还涉及编码上文描述的肽的分离的核酸。在优选的实施方式中，所述分离的核酸包含SEQ ID NO :6中所示的序列或与SEQ ID NO 6具有至少80%同一性的序列。
SEQ ID NO 6对应于shp316 (Shp316的编码基因)并对应于以下序列TTGAAAACCCTGAAAATATTTGTACTATTTTCACTACTTATTGCTATCTTGCCTTATTTTGCAGGATGT CTTTAA所述分离的核酸可以与SEQ ID NO 6具有至少80%同一性，优选与SEQ ID NO 6 具有至少85%同一性，更优选与SEQ ID NO :6具有至少90%同一性，更优选与SEQ ID NO: 6具有至少95%同一性，甚至更优选与SEQ ID NO :6具有至少98%同一性。在具体的实施方式中，所述分离的核酸具有以下序列TTGAAAACCCTGAAAATATTTGTACTATTTTCACTACTTATTCCTATCTTGCCTTATTTTGCAGGATGT CTTTAA(SEQ ID NO 7)该序列与SEQ ID NO :6具有高于98%同一性，并且在嗜热链球菌菌株CNCM 1-2423的基因组中检测到该序列。在具体的实施方式中，所述分离的核酸具有以下序列TTGAAAAAACTAAAATTATTTACACTATTCTCACTACTTATCACTATCTTGCCCTATTTTACAGGTTGT CTTTAA(SEQ ID NO 8)该序列与SEQ ID NO :6具有高于84%同一性，并且在唾液链球菌菌株SK126 (登录号NZ_ACL001000018)的基因组中检测到该序列。本发明还涉及包含上文所述的分离核酸的载体。通常，所述载体可以为质粒，即作为自复制(即其包含复制起点)或整合载体的环形双链DNA分子。上文描述的肽、核酸和载体可在属于链球菌属的细菌中、尤其是属于嗜热链球菌种或唾液链球菌种的细菌中用于诱导或提高感受态。因此，本发明的肽、核酸和载体可通过天然遗传转化用于转化属于链球菌属的细菌，尤其是属于嗜热链球菌种或唾液链球菌种的细菌。因此，本发明还涉及在属于链球菌属的细菌中诱导感受态的方法，所述方法包括用上文描述的表达载体转化所述细菌的步骤。本发明还涉及在属于链球菌属的细菌中诱导和/或提高感受态的方法(方法B)， 其中在包含本发明的肽和/或产生本发明的肽的细菌的培养基中孵育所述细菌。本发明还涉及所述感受态细菌和通过该方法B可获得的具有改良的感受态的细菌。特别地，本发明涉及试剂盒，其包含-在第一部分中的属于链球菌属的细菌；和-在第二部分中的本发明的肽和/或产生本发明的肽的细菌。本发明还涉及通过用多核苷酸的天然遗传转化而转化属于链球菌属的细菌的方法(方法C)，所述方法包括以下步骤a)向属于链球菌属的所述细菌的培养基中加入本发明的肽和/或产生本发明的肽的细菌和b)加入所述多核苷酸。步骤a)和b)可以顺次或同时进行。根据该方法，在包含以下组分的生长培养基中孵育所述细菌
a)本发明的肽。所述肽可以以多种方式加入。在优选的实施方式中，将所述肽直接加入至所述培养基中。通常，所述肽可以是合成肽或重组肽。获得肽的方法是本领域技术人员熟知的标准方法。通常，所述肽可以以IOOnM-IO μ M，优选500ηΜ_2500ηΜ，甚至更优选 200ηΜ-2000ηΜ，甚至更优选约IOOOnM的浓度使用。在另一个实施方式中，所述肽被细菌分泌，其作为共培养物加入至属于链球菌属的细菌中。b)多肽，其待转化属于链球菌属的细菌。通常，所述多核苷酸在引入至细菌中时赋予细菌目的表型，即噬菌体抗性、蛋白水解活性、胞外多糖生物合成、天然感受态。在一个实施方式中，所述多核苷酸是包含如上文描述shp316基因的核酸。所述多核苷酸可以，例如编码蛋白，例如蛋白酶、肽酶、糖基转移酶或细菌素。通常，所述多核苷酸可以是基因序列的一部分、一个基因序列或多个基因序列。所述多核苷酸可以是线性或环形的。通常，所述多核苷酸可以是质粒，其在所转化的细菌中可以自复制或者不可自复制。通常，所述多核苷酸可以经设计以有助于通过同源重组将其引入至细菌的基因组中。所述多核苷酸可以是单链的线性DNA。通常，所述多核苷酸的尺寸包括10bp-100kbp，优选IOObp-IOkbp或100bp_50kbp， 更优选500bp-30kbp，甚至更优选lkbp-20kbp，更优选500bp_25kbp，甚至更优选 lkbp_16kbp。通常，多核苷酸在生长培养基中的浓度包括0. lyg/L_2g/L，优选0.5 μ g/ L-1. 5g/L，更优选 1 μ g/L-lg/1。本发明还涉及通过上述方法C获得的转化细菌。通过将来自一个菌株的DNA的目的特征(蛋白水解活性、氨基酸生物合成、细菌素生产、胞外多糖生产、有利代谢物的生产、噬菌体抗性、天然感受态...)转移至另一个菌株，并允许在相同遗传背景下产生独特的组合，上述肽、核酸、载体、方法和细菌可用于改善用于发酵食品和饲料业(或使用嗜热链球菌或唾液链球菌的其它行业)的链球菌菌株，并且尤其是嗜热链球菌或唾液链球菌的菌株。根据期望的特征选择合适的多核苷酸用于这种转化在本领域技术人员的能力范围内。从上述方法(方法B和C)获得的属于链球菌属的细菌可用于食品业，尤其是奶产品的制造中。通常，上述细菌归属于“公认安全使用物质”(GRAS)。因此，本发明还涉及获得食品或饲料产品的方法，所述方法包括使用通过上述方法(方法B和C)获得的细菌的步骤。本发明还涉及通过所述方法可获得的食品或饲料产品。本发明还涉及包含上述方法(方法B和C)获得的细菌的食品或饲料产品。在优选的实施方式中，对于上述方法(方法B和方法C)，所述属于链球菌属的细菌表达编码转录调节子STER_0316的基因STER_0316。确实，发明人还发现了用于阻断属于链球菌属的细菌中，尤其是属于嗜热链球菌种的细菌中的天然感受态的方法。确实，发明人发现，Shp316(或任意“成熟”的》!ρ316)及其同族调节子(cognate regulator) STER_0316是天然感受态必需的。因此，本发明另一方面涉及转录调节子(Rgg) STER_0316 (SEQ ID NO :9)。本发明因此涉及具有SEQ ID NO :9所示的氨基酸序列的多肽或与SEQ ID N0:9具有至少85%同一性、优选与SEQ ID NO :9具有至少90%同一性、更优选与SEQ ID NO :9具有至少95%同一性、甚至更优选与SEQ ID NO :9具有至少98%同一性的其变体。在具体的实施方式中，所述多肽具有序列SEQ ID NO :10。该序列与SEQ ID NO :9具有高于98%的同一性，并且推定其来自嗜热链球菌菌株 CNCM 1-2423的基因组。在具体的实施方式中，所述多肽具有序列SEQ ID NO 11。该序列与SEQ ID NO :9具有高于93 %的同一性，并且推定来自唾液链球菌菌株 SK126的基因组。本发明还涉及分离的核酸STER_0316(其编码转录调节子STER_0316)，其包含SEQ ID NO: 12或与SEQ ID NO 12具有至少80%同一性、优选与SEQ ID NO 12具有至少85%同一性、优选与SEQ ID NO :12具有至少90%同一性、更优选与SEQ ID N0:12具有至少95% 同一性、甚至更优选与SEQ ID NO :12具有至少98%同一性的其变体。在具体的实施方式中，所述分离的核酸具有序列SEQ ID NO :13。该序列与SEQ ID NO :12具有高于99 %同一性，并且在嗜热链球菌菌株CNCM 1-2423的基因组中检测到该序列。在具体的实施方式中，所述分离的核酸具有序列SEQ ID NO :14。该序列与SEQ ID NO :12具有高于91%的同一性，并且在唾液链球菌菌株SKU6的基因组中检测到该序列。本发明还涉及阻断属于链球菌属的细菌中，尤其是属于嗜热链球菌种或唾液链球菌种的细菌中的天然感受态的方法，所述方法包括使STER_0316基因和/或shp316基因失活的步骤。本发明还涉及提高属于链球菌属的细菌中，尤其是属于嗜热链球菌种或唾液链球菌种的细菌中的天然感受态的方法，所述方法包括过表达STER_0316基因和/或shp316基因的步骤。术语“ STER_0316基因”和“ shp316基因”包括嗜热链球菌菌株LMD-9的上述 STER_0316和shp316基因(分别为SEQ ID N0:12禾口 SEQ ID NO 6)以及嗜热链球菌菌株 CNCM 1-2423和唾液链球菌SKU6和其他嗜热链球菌种或唾液链球菌种中各自的同源物。在具体的实施方式中，本发明涉及不能表达STER_0316和/或shp316或在其基因组中没有这些基因的细菌的突变体，其中引入了 STER_0316和/或shp316基因。


图1 用于肺炎链球菌和变形链球菌(S. mutans)中的DNA转化的感受态的诱导图示(1)在肺炎链球菌和变形链球菌生长过程中，引发感受态信息素基因comC的前体的转录。
(2和3)翻译基因comC并通过ComAB ABC-转运子将其分泌在细胞外培养基中。 在其分泌过程中，前体肽ComC熟化成在细胞外培养基中聚集的CSP肽。(4)在临界浓度，成熟CSP被组氨酸激酶ComD识别，组氨酸激酶ComD催化其自磷酸化。(5)磷酸基团被转移至胞质调节子ComE，使其活化。(6)磷酸化的ComE调节子活化comX和早期至关重要的感受态基因comAB⑶E的转录。(7) comX与RNA聚合酶核心结合并活化对DNA转化至关重要的基因的转录。图2 在化学限定培养基(CDM)中的菌株LMD-9中comX表达诱导的模型图示(改自 Gardan et al. ,2009 ；J.Bacteriol)(1)在CDM生长条件中，可能诱导编码感受态信息素的前体的特定基因的表达。(2)相应的信息素被翻译并且可能然后被分泌到细胞外培养基中，在此其可能最终被熟化⑶。(4)在临界浓度，所述感受态信息素可能被特异识别并且被Ami转运子内化。(5)进入细胞质后，信息素可能与导致其活化和随后的comX转录诱导的特定转录调节子相互作用(6)。图3 用于测试嗜热链球菌LMD-9、LMG18311和CNRZ1066的天然转化率的策略的图示用于转化试验的外源DNA是自杀质粒pGIUD0855ery。该质粒是pUC18的衍生物， 包含约11Λ的两个片段，该两个片段对应于来自菌株LMG18311的stu0855的上游(UP)和下游(DOWN)区。所述质粒还包含由启动子PCTy和红霉素抗性基因ery的融合体组成的表达盒。分别将stu0855的上游和下游区克隆在pUC18的PCTy-ery表达盒的上游和下游，以获得质粒pGIUD0855ery。在天然转化过程中，PGIUD0855ery的表达盒PCTy_ery将通过双同源重组(用虚线表示)整合在STER_0891基因座(stu0855或str0855基因座，取决于受体菌株)，并取代染色体中的STER_0891开放阅读框(或stu0855或str0855开放阅读框)。 用于检测PCTy_ery在预期基因座的整合的引物对upstu0855/DOwnstu0855用箭头表示。图4 用于构建嗜热链球菌LMD-9 Δ (StblpD-StblpX) Pcomx-IuxAB的策略的图示载体pGIUDblp 是 pGhost9 的衍生物(Maguin, E.，P. Duwat, T. Hege, D. Ehrlich, and A.Gruss. 1992. New thermosensitive plasmid for gram-positive bacteria. J. Bacteriol. 174 :5633-5638)。通过接连克隆分别对应于LMD-9菌株的Blp细菌素基因的上游(UP)和下游(DOWN)区的约11Λ的两个片段而获得该载体。pGIUDblp载体还包含由来自嗜热链球菌LMD-9的启动子P。。mX和来自发光杆菌(Wiotorabdus luminescens) 的IuxAB基因之间的融合体组成的表达盒(所述融合体描述在图下侧)。在pGIUDblp的上游和下游区之间克隆该表达盒。如之前的描述(Maguin, E.，H. Prevost, S. D. Ehrlich, 以及 A. Gruss. 1996. Efficient insertional mutagenesis in lactococci and other gram-positive bacteria. J. Bacteriol. 178 :931-935)，通过两步同源重组过程用 Pcomx-IuxAB盒取代blp基因(用虚线表示)。图5 在化学限定培养基(CDM)中的菌株LMD-9中comX表达诱导的模型图示(由以上描述的实施例推定)
(1)在CDM生长条件下，引发感受态信息素基因shp316的前体的转录。(2和幻翻译基因shp316并通过仍未鉴定的分泌系统将其分泌在细胞外培养基中。前体肽aip316熟化并在细胞外培养基中聚集。(4)在临界浓度，成熟》ιρ316*被识别并且被寡肽Ami转运子内化。(5)成熟与转录调节子STER_0316相互作用并活化之。(6)调节子 STER_0316 活化 comX 和 shp316 的转录。图6 在嗜热链球菌中进行靶向诱变的策略的图示(1)进行三个单独的PCR反应以扩增片段A、B和C。片段A对应于目的基因(即必须删除的基因)的上游区。用引物对0L1/0L2扩增片段A。片段B对应于氯霉素表达盒 P32-Cat并且用引物对0L3/0L4扩增。片段C对应于目的基因的下游区并用引物对0L5/0L6 扩增。0L3和0L4的序列分别与0L2的5’末端和0L5的5’末端互补(浅灰线表示)。(2)以等摩尔浓度混合PCR产物A、B和C。(3)利用引物对0L1/0L6进行重叠PCR以将片段A、B和C连接在一起。(4)通过天然感受态将重叠PCR产物转移到在CDM中生长的LMD-9 Δ (StblpD-Stb ΙρΧ) Pcomx-IuxAB菌株中。通过双同源重组用P32-cat表达盒取代目的基因。图7 用于检测嗜热链球菌菌株的天然转化率的策略的图示用于转化试验的外源DNA是自杀质粒pGID0855cat。该质粒是pUC18的衍生物， 包含约11Λ的两个片段，该两个片段对应于来自菌株LMG18311的stu0855的上游(UP)和下游(DOWN)区。所述质粒还包含由来自乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的组成型启动子P32和氯霉素抗性基因cat之间的融合体组成的表达盒。在pGID0855cat的上游和下游区之间克隆该表达盒。在天然的转化过程中，PGIUD0855cat的P32_cat表达盒将通过双同源重组整合在stu0855基因座(用虚线表示)，并取代染色体中的stu0855开放阅读框。用于检测P32-Cat在预期基因座的整合的引物对upstu0855/DOwnstu0855用箭头表示。在任何试验前通过PCR检测所有嗜热链球菌中stu0855基因座的存在(数据未显示)。图8 :42°C培养在牛奶中的CNRZ1066和CNRZ1066prtS的酸化动力学图9 菌株LMD_9(A)和菌株LMG18311(B)中的his基因座的图示小黑箭头表示在进一步构建和分析中使用的引物。图10 在嗜热链球菌中进行靶向诱变的策略的图示(1)进行三个单独的PCR反应以扩增片段A、B和C。片段A对应于目的基因(即必须删除的基因)的上游区。用引物对UP1/UP2(黑箭头)扩增片段A。片段B对应于氯霉素表达盒P32-Cat并且用引物对UploX66/DNloX71扩增。片段C对应于目的基因的下游区并用引物对DN1/DN2扩增。Uplox66和DNlox71的序列分别与UP2的5，末端和DNl的5，末端互补。(2)以等摩尔浓度混合PCR产物A、B和C。(3)利用引物对UP1/DN2进行重叠PCR以将片段A、B和C连接在一起。(4)通过天然感受态将重叠PCR产物转移到在CDM中生长的LMD-9菌株中。通过双同源重组用P32-cat表达盒取代目的基因。图11 通过Cre介导的删除实现从染色体除去lOX66-P32Cat-lOX71表达盒在Cre重组后，将突变1οχ66和1οχ71位点重组至大幅降低对于Cre的结合亲和性的双突变1οχ72位点中。图12 :LMD-9 (方形)和LMD-9 δ His (三角形)在CDM(黑色符号)和缺乏组氨酸的CDM(白色符号)中的生长比较图13 :LMG18311(方形)和LMG18311 :His (三角形)在CDM(黑色符号)和缺乏组氨酸的CDM(白色符号)中的生长比较图14 :LMG18311、LMG18311: :His和通过用LMD-9DNA提取物天然诱导转化获得的多个his阳性分离物在缺乏组氨酸的CDM中的生长比较
实施例下文描述的试验提供了嗜热链球菌和唾液链球菌中的天然感受态严格依赖于源自由shp316基因编码的Sip316肽的信号肽的分泌和感受的证据。具体地，以下实施例证明 基因STER_0316(SEQ ID NO :12)编码负责comX诱导的转录调节子(Rgg) (SEQ ID NO 9)。· shp316基因(SEQ ID NO 6)是用于感受态信息素Sip316 (短疏水肽316)的结构基因(SEQ ID NO :1)。 可以通过带有shp316的质粒修复shp316删除的菌株的感受态缺陷。 可以通过在培养基中加入源自Sip316的合成肽而修复shp316删除的菌株的感受态缺陷。 可以通过在培养基中加入源自Sip316的合成肽而改善化学限定培养基(CDM) 中菌株嗜热链球菌LMG18311和CNRZ1066以及唾液链球菌JIM8777的低转化率。 源自》!ρ316的合成肽能够在多数嗜热链球菌菌株中诱导天然感受态。 天然感受态可以用于有利地修饰嗜热链球菌菌株的功能特征，例如营养要求和酸化特征。对于嗜热链球菌LMD-9、LMG18311和CNRZ1066 (它们是通常安全的嗜热链球菌菌株)和唾液链球菌JIM8777(其是从人口腔分离的)进行试验。还在试验6中对其它菌株进行测试。1. STER_0316的删除损害了 CDM中的comX诱导和天然转化为了具有在comX基因的启动子控制下的发光基因，构建了嗜热链球菌菌株。 在这种构建体中，仅在表达comX基因时才将测定到发光增加。将所构建的菌株命名为 LMD9-Ablp::P。。mX-luxAB。该构建体在图4中显示。在该构建体中，部分blp操纵子(自 blpD至blpX)被删除(6)并且被报告子盒取代，在所述报告子盒中来自发光杆菌的荧光素酶基因IuxAB与P。。mX融合。选择该启动子，原因是其证明在生长在CDM中的嗜热链球菌 LMD-9的天然感受态的形成过程中，comX被强烈诱导(7)。发明人在LMD9_Ablp: Pcomx-IuxAB菌株中进行了 Rgg编码基因STER_0316的删除。用于进行靶向诱变的方法描述在下文(参见图6)。通过重叠PCR体外制备含期望插入/删除的DNA片段并通过感受态转移至CDM培养条件中的LMD9- Ablp:: Pcomx-IuxAB菌株中(7)。重叠片段由位于靶基因侧翼并被P32-cat片段分开的两个1.21Λ的重组片段构成 (图6)。然后在含氯霉素(5 μ g/mL氯霉素)的M17-乳糖琼脂培养基上选择期望的突变体并利用引物对Ch0316A/Ch0316B通过PCR检测其身份。使用以下引物OLl 5' -AAACAATGGTGGCCCAGGATCAATGATTGGG-3‘0L2 5' -CCTTATGGGATTTATCTTCCTTAGATTCTTAGTCCAATGCT-3‘0L3 5' -TAAGGAAGATAAATCCCATAAGG-3‘0L4 5' -TTCACGTTACTAAAGGGAATGTA-3‘0L5 5' -TACATTCCCTTTAGTAACGTGAAGTTTTGGAAGACTCGG-3‘0L6 5' -CAATAATAGCAGTATTGACCTGACTATTTGCCTCC-3‘Ch0316A 5' -TAAGAGTGCTATTGGTGTTCTCTTGC-3‘Ch0316B 5' -TCATGGAATTTCACCTCAATTTCTTGC-3‘通过监测CDM生长条件下由P。。mX驱动的发光来计算Rgg-编码基因STER_0316的删除对感受态的影响。在M17-乳糖培养基中预培养LMD9-Ablp: :P。。mX-luxAB衍生物。收集预培养的细胞(5000g，9分钟，20°C)并在CDM培养基中洗涤2次。利用洗涤后的细胞接种 CDM培养基以获得在600nm为0. 05的光密度。然后将小体积嗜热链球菌培养物(300 μ 1) 转移在透明底的白色微孔板(655095 ；Greiner, Alphen a/d Rijn, The Netherlands)中并在37°C培养。利用自动化Synergy HT多模式微孔板读数仪记录在595nm的发光和在600nm 的光密度(0D·)。由LuxAB催化的荧光素酶活性需要壬醛存在作为底物。在该实验中，发明人通过将在矿物油中稀释的含壬醛(Acros Organics ref. 204-688-5)的50 μ 1溶液放置于带盖微孔板的孔之间的空隙内，而向培养物中提供挥发形式的壬醛(11)。溶液中存在的壬醛将挥发并将在空气和培养样本之间形成壬醛浓度的平衡。在6小时内每10分钟扫描一次发光和吸光度。将突变菌株的最大RLU/0D与原始菌株进行比较。Rgg基因STER_0316 的删除对 LuxAB 活性具有负作用(LMD9-Ablp: Pcomx-IuxAB Δ STER_0316: :P32_cat 突变体结果示于表1 ；对于每次实验仅显示最大RLU/0D值)。表1 在CDM中培养的LMD9_Ablp: Pcomx-IuxAB衍生物的最大荧光素酶活性
Rgg编码基因被删除菌株最大荧光素酶活性 (RLU/OD)无\MD9-Ablp·. -.YcomX-IuxAB9970STER—0316lMD9^blp\: comX-luxAB ASTER_0316::P32cat103.8确实，在菌株LMD9-Ablp: :Pc。mX_luxAB Δ STER_0316: :P32_cat 中测定的最大 RLU/0D值比亲本菌株中低96倍。这些结果表明，调节子STER_0316是控制comX表达的主要因子。由于证明STER_0316的删除显著降低了 comX的转录，预期菌株 LMD9-Ablp: Pcomx-IuxAB ASTER_0316: :P32_cat中的感受态也将受到影响。确实，已知 ComX是负责表达晚期感受态基因的主要σ因子。对于该实验工作，比较了菌株LMD9-Ablp: Pramx-IuxAB和LMD9-Ablp: Pcomx-IuxAB Δ STER_0316: :P32_cat的转化率。这两个菌株均对红霉素敏感。供体DNA是质粒pGIUD0855ery (图幻。该质粒在嗜热链球菌中不能复制，其包含与 stu0855(来自LMG18311菌株的嗜热链球菌基因)的左末端和右末端融合的可操作红霉素抗性基因(PCTy_ery)。进行实验，以在获得PCTy_ery表达盒时赋予菌株LMD-9红霉素抗性。在存在或不存在所添加的质粒pGIUD0855ery的情况下，在含300 μ LCDM的微孔板中培养两个菌株。按照以上描述进行预培养和培养。在一组实验中，在接种的同时将ι μ g/ mL质粒pGIUD0855ery添加至培养物中，在第二组实验中没有添加质粒DNA。培养所述培养物6小时并将系列稀释物铺在含红霉素的M17-乳糖琼脂培养基的表面。下表2显示了所述实验的结果。表2 添加或没有添加供体DNA(lyg/mL)时生长在CDM中的 LMD9- Ablp: Pcomx-IuxAB 衍生物的转化率
权利要求
1.具有SEQID NO :1所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO :1具有至少75%同一性的肽或所述肽的片段，其中所述肽或所述片段能够诱导或提高嗜热链球菌(S. thermophilus) 菌株的感受态。
2.如权利要求1所述的肽或其片段，其中，所述肽或其片段能够诱导或提高其中编码 SEQ ID NO 1的基因已经被失活的嗜热链球菌菌株LMD-9的感受态。
3 如权利要求1或2所述的肽或其片段，其中，所述肽或其片段-与SEQ ID NO :1具有至少75%同一性，优选与SEQ ID NO :1具有至少79%同一性， 更优选与SEQ ID NO :1具有至少83%同一性，甚至更优选与SEQ ID NO :1具有至少87%同一性，甚至更优选与SEQ ID NO :1具有至少91%同一性，甚至更优选与SEQ ID N0:1具有至少95%同一性；和-与SEQ ID NO :1的第6- 位具有至少84%同一性，更优选与SEQ ID N0:1的第6- 位(对应于SEQ ID NO 4)具有至少89%同一性，甚至更优选与SEQ ID NO 1的第6- 位 (对应于SEQ ID NO 4)具有至少94%同一性。
4.如前述任一个权利要求所述的肽或其片段，其中，所述肽或其片段包含至少7个氨基酸，优选至少6个氨基酸，甚至更优选至少5个氨基酸，甚至更优选至少4个氨基酸。
5.如前述任一个权利要求所述的肽或其片段，其中，所述肽或其片段包含至多M个氨基酸，至多23个氨基酸，至多22个氨基酸，至多21个氨基酸，至多20个氨基酸，优选至多 19个、至多18个、至多17个、至多16个、至多15个、至多14个、至多13个、至多12个、至多11个、至多10个、至多9个氨基酸，甚至更优选至多8个、至多7个、至多6个、至多5个或至多4个氨基酸。
6.如前述任一个权利要求所述的肽或其片段，其中，所述肽或其片段包含SEQID NO 2所示的氨基酸序列。
7.如前述任一个权利要求所述的肽或其片段，其中，所述肽或其片段包含SEQID NO 3所示的氨基酸序列。
8.如前述任一个权利要求所述的肽或其片段，其中，所述肽或其片段包含SEQID NO 4所示的氨基酸序列。
9.如前述任一个权利要求所述的肽或其片段，其中，所述肽或其片段的C-末端具有选自AGCL或TGCL的氨基酸序列。
10.如前述任一个权利要求所述的肽或其片段，其中，所述肽或其片段的C-末端具有选自 PYFAGCL、LPYFAGCL、ILPYFAGCL、AILPYFAGCL、PYFTGCL 的氨基酸序列。
11.如前述任一个权利要求所述的肽或其片段，其中，所述肽或其片段示于附文III中。
12.如前述任一个权利要求所述的肽或其片段，其中，所述肽或其片段是氨基酸序列 AGCL或TGCL，或包含氨基酸序列AGCL或TGCL。
13.如前述任一个权利要求所述的肽或其片段，其中，所述肽或其片段是以下氨基酸序列或包含以下氨基酸序列PYFAGCL、LPYFAGCL、ILPYFAGCL、AILPYFAGCL 或 PYFTGCL。
14.分离的核酸，其编码权利要求1-13中任一项所述的肽或其片段。
15.如权利要求14所述的分离的核酸，其中，所述分离的核酸包含SEQID NO :6所示的序列或与SEQ ID NO :6具有至少80%同一性的序列。
16.如权利要求15所述的分离的核酸，其具有SEQID NO :7所示的序列。
17.如权利要求16所述的分离的核酸，其具有SEQID NO :8所示的序列。
18.载体，其包含权利要求14-17中任一项所述的分离的核酸。
19.诱导和/或提高属于链球菌属(Str印tococcusgenus)的细菌的感受态的方法，其中，在包含权利要求1-13任一项所述的肽和/或产生权利要求1-13任一项所述的肽的细菌的培养基中培养所述细菌。
20.试剂盒，其包含-在第一部分中的属于链球菌属的细菌；和-在第二部分中的权利要求1-13任一项所述的肽和/或产生权利要求1-13任一项所述的肽的细菌。
21.通过用多核苷酸的天然遗传转化而转化属于链球菌属的细菌的方法，所述方法包括以下步骤a)向属于链球菌属的所述细菌的培养基中加入权利要求1-13任一项所述的肽和/或产生权利要求1-13任一项所述的肽的细菌和b)加入所述多核苷酸。
22.通过权利要求19或21所述的方法获得的细菌。
23.获得食品或饲料产品的方法，其包括使用权利要求22所述的细菌的步骤。
24.通过权利要求23所述的方法获得的食品或饲料产品。
25.食品或饲料产品，其包含通过权利要求19或21所述的方法获得的细菌。
26.阻断属于链球菌属的细菌中，尤其是属于嗜热链球菌种或唾液链球菌 (S. salivarius)种的细菌中的天然感受态的方法，所述方法包括使其它嗜热链球菌或唾液链球菌菌株中的STER_0316基因和/或shp316基因或其各自的同源物失活的步骤。
27.提高属于链球菌属的细菌中，尤其是属于嗜热链球菌种和/或唾液链球菌种的细菌中的天然感受态的方法，所述方法包括过表达其它嗜热链球菌和唾液链球菌菌株中的 STER_0316基因和/或shp316基因或其各自的同源物的步骤。
全文摘要
本发明涉及肽、核酸和通过天然感受态转化属于链球菌属的细菌的方法以及其在食品和饲料业的应用。
文档编号C07K14/315GK102574898SQ201080028500
公开日2012年7月11日 申请日期2010年6月23日 优先权日2009年6月23日
发明者克里斯托夫·弗里莫克斯, 利蒂希娅·方丹, 帕斯卡尔·霍尔斯, 派翠克·布瓦亚瓦尔, 菲利普·霍瓦思 申请人:丹尼斯科公司