一种利用低活性丁二酸生产菌株转化合成富马酸的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程技术领域，设及一种利用低活性下二酸生产菌株转化合成富 马酸的方法，通过对微生物进行特定的菌种活化、种子液制备后，进行厌氧发酵生产下二酸 发酵结束后收集菌体细胞，在W下二酸钢为底物的特定培养基和培养环境下，有氧转化合 成富马酸。
【背景技术】
[0002] 富马酸(又称延胡索酸)作为一种重要的四碳平台化合物，在医药、食品W及表面 活性剂等行业有着广泛的用途，可W通过酶催化转化、醋化、加氨等工艺生产k天冬氨酸、 苹果酸、班巧酸、马来酸、1,4-下二醇、丫-下内醋和四氨巧喃等四碳化合物。目前富马酸主 要通过顺下締二酸酢异构化和慷醒氧化法生产，化学合成富马酸因成本高和环境污染等原 因使得富马酸作为基本化工原料的广泛应用受到限制。
[0003] 富马酸的生物合成法具体包括酶催化转化法和微生物发酵法。20世纪90年代中期 出现的酶催化转化法一般都是W马来酸为底物，在马来酸异构酶作用下制备富马酸，但原 料马来酸供应不足，且价格昂贵。20世纪70年代石油危机的出现，使得人们加大了对微生物 发酵法制备富马酸的研究力度，运一时期人们用来发酵制备富马酸的微生物有霉菌、酵母 及细菌。其中根霉菌化izopus为重点研究的对象，具体包括米根霉化izopus oryzae、少根 根霉Miizopusarrhizus W及黑根霉lihizopusnigricans等。在运一时期，我国科学家对微生 物发酵法生产富马酸的研究工作也进行了一定的探索，其中山西微生物研究所的白照熙等 筛选出了具有产富马酸能力的少根根霉，当振荡培养于含有12%葡萄糖的培养基时，富马酸 产量为53.15 g/L，得率为45%，同时产生了较多的副产物如苹果酸等，但发酵周期较长，需 要11天左右(食品与发酵工业，1988)。美国化rdue大学的Tsao教授等利用米根霉发酵产富 马酸，98 g/L初始葡萄糖发酵48 h，其富马酸产量为33 g/L，得率为33.7%(Bioprocess Biosyst ling, 2002, 25: 179~181)。
[0004] 发酵法生产富马酸可W利用可再生资源和二氧化碳，不仅摆脱了对石化原料的依 赖，而且开辟了溫室气体二氧化碳利用的新途径。因此，W微生物发酵法生产富马酸的研究 与开发正在美国、日本等国家深入地进行着。但霉菌生长速度慢，产品生产强度偏低。开发 对营养条件需求简单、生长迅速、收率高的C4有机酸生产菌株是加速生物法替代石化法生 产的关键。
[000引利用大肠杆菌来发酵生产富马酸，是利用了大肠杆菌生长快速、生长周期短、培养 条件简单、安全性好、价格低廉等诸多优点，实现富马酸优质高产工业化生产的方向。目前 尚无利用该菌株生产富马酸的相关报道。
【发明内容】
[0006]本发明要解决的技术问题是在产下二酸重组大肠杆菌发酵结束时，通过一种溫 和、高效的方法回收菌体细胞，并最终能够转入新鲜培养基中W下二酸钢为原料转化合成 富马酸。
[0007] 为实现本发明的技术目的，本发明采用W下技术方案： 一种利用低活性下二酸生产菌株转化合成富马酸的方法，包括W下步骤： (1) 菌种活化:从甘油冻存管中取菌液，在LB平板上划线后放置于37°C下培养12 h; (2) 种子液制备:从LB平板上取单菌落，接种于LB液体培养基，在37°C，200 r/min条件 下摇瓶培养6~8 h，至菌体密度0D600值在0.6~0.8之间； (3) 发酵产下二酸过程:按3~10%的接种量接种发酵培养基，先同空气有氧培养至菌体 密度0D600值在30~40之间，再W0 . ^0.2 vvm的通气流量连续通二氧化碳气体维持发酵罐 中厌氧环境，并W碳酸钢作为酸中和剂控审虹Η值在6.4-7.0之间，控制溫度在35~40°C; (4) 在一次厌氧发酵结束时，回收菌体细胞，在转化培养基中维持溶氧，溫度及发酵液 pH值，W下二酸二钢为底物，转化合成富马酸。
[0008] 所述的菌种为产下二酸重组大肠杆菌。
[0009] 进一步地，所述的菌种为Escherichia coli AFP111。
[0010] 所述步骤(4)中厌氧发酵结束时，回收的菌体细胞转化采用的特定培养基为JSM- CP培养基。该JSM-CN培养基含有:葡萄糖40 g · L-1;巧樣酸3 g · L-1;(畑4)2册〇4 8 g · L-1; 畑此10.2邑*1-1;(畑4)2504 0.75 邑*1-1;]\%504*7此0 1.00邑*1-1;〔曰(：12*2此0 10.0 m邑· L-i;ZnS〇4 · 7此0 0.5 m邑· L-i;CuCl2 · 2此0 0.25 m邑· L-i;MnS〇4 ·此0 2.5 m邑· L-1; CoCl2 · 6出0 1.75 mg · L-1;曲B03 0.12 mg;Al2(S〇4)3 ·址2〇 1.77 mg · L-1;化2Mo〇4 · 2此0 0.5 mg · L-1;巧樣酸铁 16.1 mg · L-i;VBi 20 .mg L-1;生物素 2 mg · L-1。
[0011] 进一步地，步骤(4)中所述的溶氧>20%，所述溫度为33~36°C，所述pH在6.8~7.5之 间。
[0012] 进一步地，步骤(3)中所述发酵产下二酸过程为48小时。
[0013] 本发明的有益效果在于： 本发明的技术方案，W回收的低活性的产下二酸重组大肠杆菌为催化剂，下二酸钢为 底物，有氧转化合成富马酸，其转化率达到92%W上，低活性下二酸菌体细胞，提高了细胞的 利用效率，有效节约了成本。
【附图说明】
[0014] 图1富马酸生产过程曲线图。
【具体实施方式】
[001引本发明中所述的菌株及培养基： 菌株：Escherichia coli AFPl 11，菌株来源为：Appl ied and environmental microbiology ,2001,67(1): 148-154。申请人首先通过查阅到该生物材料的上述文献出处， 并联系了发表人系美国芝加哥大学的David P. Clark教授，并邮件请求其赠与该生物材 料，并免费获得了该生物材料，且申请人保证从本申请日起二十年内向公众发放该生物材 料。
[0016] 培养基； (1)LB种子液培养基:酵母粉5 g-L-i;蛋白腺10 g-L-i;NaCl 5 g-L-i; (2)JSM发酵培养基：葡萄糖40 g.L-1;巧樣酸3 g.L-i;Na2册〇4.7出0 3 g.L-1; KH2PO4 8 邑· 1-1;(畑4)2册〇4 8 邑· L-i;NH4C1 0.2 邑· L-i;(NH4)2S〇4 0.75 邑· L-i;MgS〇4 · 7出0 1.00 邑· L-i;CaCl2 · 2出0 10.0 m邑· L-i;ZnS〇4 · 7出0 0.5 m邑· L-i;CuCl2 · 2此0 0.25 m邑· L-i;MnS〇4 ·此0 2.5 m邑· L-i;CoCl2 · 6出0 1.75 m邑· L-1;曲B03 0.12 m邑；A!2 (S〇4)3.xH2〇 1.77 mg.L-i;Na2Mo〇4.2H2〇 0.5 mg.L-i;巧樣酸铁 16.1 mg.L-i;VBi 20 .mg L-i;生物素 2 mg · [1。
[0017]下面的实施例对本发明作详细说明，但对本发明没有限制。
[001引实施例1 首先对转化过程的培养基进行了筛选，WJSM发酵培养基为参考，为解除葡萄糖效益， 葡萄糖被除去，在此基础上去除憐酸氨二钢和憐酸二氨钟(JSM-CP)，憐酸氨二锭和氯化锭 和硫酸锭（JSM-CN)W 及去除MgS04 · 7出0，CaCl2 · 2H20，ZnS04 · 7出0，化(：12*2此0，]?115〇4· 出0，CoCl2 · 6出0,出B03，Al2(S〇4)3 ?址2〇,化2Mo〇4 · 2出0,巧樣酸铁，VBi和生物素（JSM-CT) 对转化的影响，维持>40%的溶氧，溫度及发酵液抑值分别控制在35°C和6.8，初始细胞干重 DCW在10,添加的底物下二酸钢折合下二酸的质量浓度为20 g [1，转化12h后其结果见表1: 表1不同转化培养基对富马酸合成的影响
实施例2 考虑到产下二酸重组大肠杆菌不同活性下对转化下二酸的能力及产物分布有影响，因 此选择了厌氧发酵12h，24h，36h，4她回收的细胞做转化，考察其对产物分布的影响。W JSM- CP为转化培养基，维持>40%的溶氧，溫度及发酵液抑值分别控制在35°C和6.8，初始细胞干 重DCW在10,添加的底物下二酸钢折合下二酸的质量浓度为20 g [1，转化12h后其结果见表 2: 表2不同活性细胞对富马酸合成的影响
_^^ 实施例3 依据前期试验结果，选择厌氧发酵4她回收的细胞，WJSM-CP为转化培养基，维持>40% 的溶氧，溫度及发酵液pH值分别控制在35°C和6.8，初始细胞干重DCW在10，添加的底物下二 酸钢折合下二酸的质量浓度为20 g [1，其转化过程曲线图如图1所示： W上虽然已结合实施例对本发明的【具体实施方式】进行了详细的说明，但是需要指出的 是，本发明的保护范围并不受运些【具体实施方式】的限制，而是由权利要求书来确定。本领域 技术人员可在不脱离本发明的技术思想和主旨的范围内对运些实施方式进行适当的变更， 而运些变更后的实施方式显然也包括在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种利用低活性丁二酸生产菌株转化合成富马酸的方法，其特征在于，包括以下步 骤： (1) 菌种活化:从甘油冻存管中取菌液，在LB平板上划线后放置于37°C下培养12 h; (2) 种子液制备:从LB平板上取单菌落，接种于LB液体培养基，在37°C，200 r/min条件 下摇瓶培养6~8 h，至菌体密度0D600值在0.6~0.8之间； (3) 发酵产丁二酸过程:按3~10%的接种量接种发酵培养基，先同空气有氧培养至菌体 密度0D600值在30~40之间，再以0.1~0.2 vvm的通气流量连续通二氧化碳气体维持发酵罐 中厌氧环境，并以碳酸钠作为酸中和剂控制pH值在6.4-7.0之间，控制温度在35~40°C; (4) 在一次厌氧发酵结束时，回收菌体细胞，在转化培养基中维持溶氧，温度及发酵液 pH值，以丁二酸二钠为底物，转化合成富马酸。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的菌种为产丁二酸重组大肠杆菌。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中厌氧发酵结束时，回收的菌 体细胞转化采用的特定培养基为JSM-CP培养基。4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的JSM-CN培养基含有:葡萄糖40 g · L -S柠檬酸3 g .1/^(^4)2^04 8 g.L-SNIUCl 0.2 g.L-S(NH4)2S〇4 0.75 g.L-1; MgS〇4 · 7H20 1.00 g · L-SCaCl2 · 2H20 10.0 mg · L-SZnSCk · 7H20 0.5 mg · L-SCuCh · 2H20 0.25 mg · L-SMnSCk · H20 2.5 mg · L-SCoCh · 6H2O 1.75 mg · L-SH3BO3 0.12 mg; Al2(S〇4)3.xH2〇 1.77 mg · 0.5 mg· L-1;柠檬酸铁 16.1 mg· L-SVBi 20. mg L-S 生物素 2 mg · L-、5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中所述的溶氧>20%，所述温度为33 ~36°C，所述pH在6 · 8~7 · 5之间。6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述发酵产丁二酸过程为48小 时。
【专利摘要】本发明涉及一种利用低活性丁二酸菌体细胞转化丁二酸为富马酸的方法，具体步骤包括菌种活化，种子液制备，发酵产丁二酸，回收菌体细胞，在转化培养基中维持溶氧，温度及发酵液pH值，以丁二酸二钠为底物，转化合成富马酸。办发明所述应用目前尚无报道，与其他生物发酵生产富马酸工艺相比，该方法其底物转化率在92%以上，有效利用了低活性丁二酸菌体细胞，大大降低了生产成本。
【IPC分类】C12R1/19, C12N1/20, C12P7/46
【公开号】CN105543295
【申请号】CN201610125738
【发明人】马江锋, 戴仲雪, 董维亮, 章文明, 吴昊, 姜岷
【申请人】南京工业大学
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2016年3月7日