一种微生物转化的方法
【技术领域】
[0001] 本发明采用摩根菌转化左旋多己生产丹参素，属于工业微生物领域。
【背景技术】
[0002] 丹参素，学名R-( + )-3-(3,4-二径基苯基)-2-径基丙酸、0-( + )-β-(3,4-二径基苯 基）乳酸，英文名为：Danshensu、（R)-( + )-3-(3,4-Dihy化oxy地enyl )-lactic acid、（R)- ( + )-3-(3,4-Dihy化o巧地eny 1 )-2-hyh(Myp;ropanoic acid，是一种右旋酪酸类化合物。
[0003] 丹参素是丹参水提液中的重要要有效成份，国内于1980年从丹参水提液中得到并 鉴定了结构(丹参水溶性有效成分的研究，Π .0( + )β(3,4-二径基苯基)乳酸的结构，上海第 一医学院学报，1980,05(7) ,384-385)，各种研究表明丹参素具有重要的药理药效作用，在 屯、脑血管疾病的治疗等方面具有独特治疗作用。
[0004] 当前丹参素主要从丹参中提取得到(专利CN200810038853.9)。丹参素在丹参中的 含量较低，并且丹参素种植成本高且产量有限，因此当前丹参素不仅价格高而且远远无法 满足市场的需求。专利CN201310559498.0提出了一种构建大肠杆菌基因工程图利用葡萄糖 发酵产丹参素的方法，由于合成代谢途径设及利用径基化酶，该酶很容易使代谢过程产物 氧化而影响丹参素的产率，同时由于大肠杆菌发酵是高耗氧过程，也会氧化丹参素，因此当 前该方法产率较低，成本将会高于植物提取过程。专利CN201210190171.6提出了水解丹酪 酸Β生产丹参素的方法，丹酪酸Β需从丹参提取，并且化学水解过程有大量副反应，同样不适 用于规模化生产。手性合成丹参素（专利CN201210420488.4)的催化剂极为昂贵，当前也仅 停留在实验室水平。
[0005] 基于丹参素的重要应用价值，本专利提出了采用摩根菌属微生物转化左旋多己生 产丹参素的方案。左旋多己也叫：L-3-( 3,4-二径基苯基）丙氨酸化-D0PA，1^-3,4- dihy化oxy地enylalanine)。当前左旋多己可从植物提取也可微生物发酵生产（Overview on the biotechnological production of L-DOPA，2015，Appl Microbiol Biotechnol， 99:575-584)，原料丰富易得。
[0006] 摩根菌(Morganella)是一类可使苯丙氨酸氧化脱氨的革兰氏阴性细菌。现有2个 种和2个亚种：摩根摩根菌（Morganella morganii)、耐冷摩根菌（Morganella psychrotolerans)、摩根摩根菌摩根亚种（Morganel la morgani i subsp.morgani i)和摩根 摩根菌西伯尼亚种(Morganella morganii subsp.Sibonii subsp.)。摩根菌具有强大的氧 化脱氨能力（Sherris Medical Mic;robiology，2004,4th ed.)，左旋多己可W被摩根菌氧 化脱氨成3,4-二径基苯丙酬酸，然后再还原成丹参素。3,4-二径基苯丙酬酸虽然是更为直 接的底物，但价格昂贵且不稳定，因此左旋多己是最佳的底物。摩根菌是一种兼性厌氧菌， 可W在厌氧条件或好氧条件下转化生产丹参素，具有高转化率和高纯度的特点。
【发明内容】
[0007] 本发明通过培养摩根菌属微生物菌体，转化左旋多己生产丹参素，技术方案如下：
[000引 1、菌株
[0009] 本发明所用的菌株有购自美国ATCC菌种库的Morganella morganii subsp.sibonii ATCC 49948、Mo;rganella morganii subsp.mo;rganii ATCC 25830?及购 自中国工业微生物菌种保藏管理中屯、的Morganella morganii CICC 21517和购自BCCM/ LMG Bacteria Collection的Morganella psychrotolerans LMG 23374。
[0010] 2、菌体培养
[0011] 液态发酵培养基组成为:碳源〇-50g/L，氮源0-50g/L，憐酸氨二锭0-2g/L，憐酸二 氨钟0-lg/L，硫酸儀0-0.5g/L，硫酸亚铁0-0.5g/L，氯化纳0-5g/L，可调节抑至2-8，可也抑 自然;接种量为5-20%，发酵溫度为20-40°C，发酵周期为24-72小时。种子和发酵均采用此 培养基。
[0012] 用于培养菌种的碳源可W是葡萄糖、果糖、麦芽糖、木糖、薦糖、半乳糖、甘油。培养 用氮源可W是硫酸锭、氯化锭、硝酸锭、蛋白腺、酵母膏、尿素、玉米浆等有机氮源。碳源和氮 源可W是一种或多种的组合。
[0013] 液态培养菌体的过程可W采用厌氧或好氧方式。
[0014] 3、转化产丹参素
[0015] 转化过程采用的方案有：
[0016] (1)细胞的液态培养过程，将左旋多己底物加入上述的培养体系中；左旋多己添加 量为 0-3g/L。
[0017] (2)将液态发酵培养物离屯、去除发酵液得到菌体，将菌体放入含有左旋多己底物 的水溶液反应体系中进行;转化过程溫度20-40°C，pH 2-8，转化时间1-24小时。转化液中左 旋多己起始浓度为0.1 -3g/L。
[001引 4、样品的检测分析
[0019] 转化液采用PerkinElmer Series 200高效液相色谱仪检测分析，色谱条件为:流 动相是甲醇-0.1%甲酸水(40:60)、采用汉邦MegresC18色谱柱(4.6X250mm，5皿），流速 0.6ml/min、柱溫30°C、进样量20μ1、检测器波长280nm。
[0020] 采用江苏汉邦科技有限公司的DAC-HB50制备色谱柱制备转化样品，制备色谱条件 为:流动相50 %甲醇、柱溫自然、流速3ml/min、进样量5ml。样品达到色谱纯99.9%，反复进 样分离得到的产品于50°C下真空旋转蒸干。称取制备得到的样品0.5g，溶于去离子水中并 定容至50ml，采用日本爱岩AP-300全自动旋光仪测定放光度。进一步采Varian Gemini 2000(VnmrS 600MHz，600/54/ASP)分析样品的核磁数据。样品进一步采用UPLC-QTOF-MS法 分析分子量，仪器为Waters MLDI SYNAPT QT0F MS液相色谱串联四极杆飞行时间质谱仪。
【具体实施方式】
[0021] 实施例1
[0022] 转化产物的分析测定。
[0023] 配制培养基如下:酵母膏5g/L，蛋白腺lOg/L，氯化钢5g/L"500mlS角瓶中装液量 为100ml，共50瓶，120°C，20分钟灭菌。取Mo巧anella morganii CICC 21517甘油管种子液 ImL接种，发酵溫度30°C，摇床转速20化pm。培养24后，将发酵液离屯、（转速1000化pm，时间 lOmin)，去除上清液获得菌体，离屯、获得的菌体用无菌水清洗两遍。取20g湿菌体放入左旋 多己浓度为3g/L的1000ml溶液中，混合均匀。于37°C摇床振荡（100巧m)24小时后，100°C水 浴加热3分钟杀灭菌体。再离屯、（转速1000化pm，时间lOmin)去除菌体，得到转化后的上清 液。液相分析丹参素浓度为l.Og/L，剩余左旋多己浓度为1.2g/L。采用制备色谱得到0.75g 纯品。
[0024] 旋光仪分析其旋光度为?αβ" = +34.日0。核磁数据为：1H NMR(DMS0-d6,600MHz) :δ 8.77(s，lH)，6.63(dd，J = 24Hz，lH)，6.65(dd，J=12Hz，lH)，6.44(dd，J = 24Hz，lH)，5.47 (s,lH),4.06-4.17(m,lH),2.61-2.81(m,lH)；13C NMR(DMS0-d6,600MHz)：δ175.5,174.2, 144.9,144.7,143.8,143.6,128.8,128.7,120.6,120.1,117.0,116.9,115.4,115.1,71.6， 71.7,51.3。转化产物的质谱数据为：（-ESI ,negative mode)m/z: 197.0[M-1 ]。
[0025] 根据 W 上数据及相关文献（Stereochemical configuration of0-(3,4- dihydroxyphenyl)lactic acid from Rosmarinus officinalis.Ricerea Sci.80:255- 259.[化6111.463.54:24520.1960]，丹参水溶性有效成分的研究，11.〇( + )0(3,4-二径基苯 基)乳酸的结构，上海第一医学院学报，1980,05(7) ,384-385)，确定其分子及光学结构与天 然丹参素完全一致。
[00%] 实施例2
[0027]好氧培养与厌培养的比较。配制培养基:葡萄糖30g/L，蛋白腺20g/L，憐酸氨二锭 1 g/L，憐酸二氨钟Ig/L，硫酸儀0.3g/L，硫酸亚铁0.3gA;起始pH和发酵过程pH均为自然 500mlS角瓶中装液量为100ml，共2瓶，120°C，20分钟灭菌。
[00巧]取Mo;rganella morganii subsp.sibonii ATCC 49948甘油管种子液 1 血接种 1瓶， 于