一种利用方波电击进行莱茵衣藻高效建库的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种利用方波电击使得外源DNA整合进入莱茵衣藻染色体DNA的方法，特别是一种利用方波电击使得抗性DNA随机插入莱茵衣藻染色体DNA，构建随机插入的莱茵衣藻突变体文库的方法。
【背景技术】
[0002]莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)是一种真核单细胞绿藻，因其生长快、易培养，基因组小而且已被注释，生物技术手段相对成熟，细胞内生理过程的分子机制与高等动植物高度相似，因此是目前植物与动物共同的模式生物之一。采用正向遗传学插入突变手段研究表型与基因的关联性，并进一步揭示该基因的生物学功能，是目前较为直接与有效的研究手段。然而该手段的关键在于获得大量可以稳定遗传的DNA片段随机插入的突变体文库，一方面要求单克隆转化子的突变尽可能是单一插入引起，另外一方面要求DNA片段的转化尽可能获得较多的转化子，二者是相互矛盾体，前者要求在做随机插入突变的时候尽可能降低DNA的量，而提高转化子数目除了提高转化效率因素之外，增加DNA的量也可以提高转化子的数目，从而获得数目可观的突变体文库。因此，从提高DNA转化效率入手是目前构建莱茵衣藻突变体文库，或者是开展衣藻转基因技术的根本。
[0003]目前的衣藻DNA转化技术中，常用的有玻璃珠转化，电击转化等。Kindle等研究者报道了莱茵衣藻的玻璃珠转化法，该方法将去壁处理的衣藻细胞、DNA、聚乙二醇和玻璃珠震荡混匀，可以获得13个转化子/微克DNA(Kindle，1990, Proceedings of theNat1nal Academy of Sciences)。因而，早期的玻璃珠转化技术效率较低，操作较复杂，逐渐被摒弃。
[0004]电击转化技术被认为是一种最有效的DNA转化技术，最成功的案例是应用在细菌上，可达106—1(3个转化子/微克DNA。另外，RNA、DNA、蛋白质和小分子都可以使用该方法转入酵母，植物细胞与动物细胞，具有重复性好、效率高和细胞的存活率高等优点。Shimogawara等研究者报道了莱茵衣藻的电击转化方法，该方法对于细胞壁缺陷细胞CC3395的转化效率高达I.9 X 15个，然而没有检测野生型衣藻的转化效率(Shimogawara，1998, Genetics)。同样的，Ladygin研究发现使用细胞壁缺陷CW-15衣藻电击转化获得13个/5 ug DNA(Ladygin, 2003,Microb1logy)。而方波电击转化技术比指数衰减波更具有良好的重复性，对细胞损伤小等特点，然而目前使用该系统电击转化莱茵衣藻的报道还很少，效率还不够高。Takashi等研究者使用方波电击仪NEPA21，采用衰减型，高低压与正反极组合变化的方式对野生型C-9莱茵衣藻细胞进行电击转化，具体参数为①高压250 V,8 ms,50 ms间隔，衰减40%为150 V，8ms;②低压20 V，衰减40%，50 ms间隔，10次(后五次电极方向相反)，将2k抗性片段经过转化可以获得3380个转化子/ug DNA，C-9去细胞壁后使得其转化效率翻倍；利用相同的电击参数电击转化其他野生型莱茵衣藻CC-124，CC-125，CC-1690(21gr)，分别获得转化子的数目是2930个转化子/ug DNA，404个转化子/ug DNA，3400个转化子/ug DNA。如果将长片段7.8kb片段DNA进行转化，则效率下降至500个转化子/ug DNACTakashi,2012, Journal of B1science and B1engineering)0
[0005]因此寻求一种适用于有壁野生型衣藻细胞，并且操作设置简单、转化效率高的电击转化方法是迫切的，必要的，尤其是衣藻基因前期的建库研究当中。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是要提供一种利用方波电击使得外源DNA整合进入莱茵衣藻染色体DNA的方法，特别是利用方波电击进行莱茵衣藻高效建库的方法，从而解决衣藻DNA的转化效率问题。
[0007]本发明的目的是这样实现的:莱茵衣藻在TAP液体培养基，23± 0.5° C，连续光照，8000Lx光强下进行通气培养，经过转接后培养、处理，将抗性DNA片段经过方波电击转化，使得抗性DNA随机整合进入莱茵衣藻染色体中，经过过夜弱光恢复，涂布于抗性筛选平板，经过7天光周期培养，获得引起随机插入突变的突变体文库。
[0008]所述的莱茵衣藻即实验藻种:2Igr(CC1690)，属于莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii )的一个品系。该实验品系可以从衣藻实验室馈赠或从美国衣藻资源中心(Chlamydomonas Resource Center)贝勾买。
[0009]所述TAP液体培养基为:TAP盐溶液25 ml/L，磷酸盐溶液0.375 ml/L，Hutner微量元素I ml/L，乙酸I ml/L，Tris2.42 g/L，121°C高压蒸汽灭菌20 min;所述的TAP盐溶液为:NH4Cl 15 g/L, MgSO4.7Η20 4 g/L, CaCl2JH2O 2 g/L。
[0010]所述的磷酸盐溶液为:Κ2ΗΡ04288g/L, KH2PO4144 g/L;Hutner微量元素为:EDTA二钠盐 50 g/L, ZnSO4-7H20 22 g/L, H3BO311.4 g/L, MnCl2-4H20 5.06 g/L, C0C1.6H2O1.61 g/L, CuSO4-5H20 1.57 g/L, (NH4)6Mo7O24^H2O 1.1 g/L, FeSO4-7H20 4.99 g/L，用KOH或者HCl调节pH至7.0。
[0011]所述的抗性0嫩片段为从?譯6-&?1^111质粒(6.6 kb大小)中，经过内切酶EcoRI酶切、回收获得抗巴龙霉素片段(&?1^111片段，2.1 kb大小)，检测后定量为每个转化加入100
ngo
[0012]所述的方波电击条件为使用BTX ECM830电击仪，设置参数电压500 V，电击时间4ms，电击波段6-7次，每次电击时间间隔100 ms，电击完毕冰浴放置10 min。
[0013]所述的抗性筛选平板为上述TAP液体培养基的配方中加入琼脂粉15g/L，进行121° C高压蒸汽灭菌20 min，冷却至约55° C后添加巴龙霉素(Paro，即Paromomycin)，使其终浓度为10ug/ml，倒平板备用。
[0014]所述的涂布抗性筛选平板为衣藻细胞沉淀悬液与制备好的20%淀粉溶液混匀，Iml/平板涂布均匀，并保持无菌。
[0015]所述的20%淀粉溶液为依次经过70%乙醇洗涤、(TAP+60mM山梨醇)溶液洗涤，并用该溶液重悬后，加入终浓度为0.4% PEG 6000的淀粉溶液。
[0016]本发明的有益效果:利用方波电击可以获得大量的转化子，即约5600个转化子/ugDNA，从而进行莱茵衣藻21gr的高效建库。本方法与传统的玻璃珠转化法，或者指数衰减波电击转化法相比，获得转化子的数目多，效果好，适合对衣藻细胞突变体文库的构建，应用价值高。能够有效导入外源DNA片段，整合进入衣藻染色体DNA(如图所示)，获得大量具有稳定遗传的突变体藻株，达到了本发明的目的。
[0017]优点:利用方波电击转化法降低细胞损伤，提高转化效率，可以用于外源DNA整合进入衣藻染色体DNA或者高效建立突变体文库，具有良好的应用前景。
[0018]1、该藻株种质资源丰富，基因组小，功能保守，遗传分析与生化分析简单，是进行正向遗传学基因分析常用模式生物，应用范围广。
[0019]2、本发明获得的转化子数目多，可以在要建库或者其他方案不能达到理想结果的时候采用本方案。
[0020]3、本发明能有效解决莱茵衣藻外源DNA转化问题，甚至可为其他藻系的高效建库方案提供相应的参考，具有很好的推广应用价值。
【附图说明】
[0021]图1是本发明经过方波电击转化，涂布抗Paro的抗性平板，培养后获得大量突变体转化子。
[0022]图2是本发明使用藻落PCR方法检测转化子是否含有导入的抗性DNA片段视图。PCR引物为pSI 103_F1 (GATTCCCGTACCTCGTGTTG)和pSI 103_R1 (TCGTCCAGATCCTCCAAGTC)，扩增目的片段大小为263 bp;
图中，M为已知分子量的DNA片段，transf ormants为随机检测的转化子；+为使用的aphVIII片段为模板，作为阳性对照，-为使用水为模板，作为阴性对照。
【具体实施方式】
[0023]如图1和图2所示，本发明包括如下步骤:1、准备细胞、平板与制备DN