特异启动子NtR12驱动AhRESS提高花生发状根系产白藜芦醇的方法
【技术领域】
[0001 ]本发明设及特异启动子化R12驱动AhRESS在花生发状根系产白襲芦醇的方法，属 于植物基因工程领域。 技术背景
[0002] 白襲芦醇(Resveratrol，简称Res),是一种重要的植物抗毒素，存在于虎杖、葡萄、 花生等植物中，在葡萄果皮和花生根中含量尤为丰富。它具有多种生物活性，是一种天然的 抗氧化剂，可W降低血脂，抑制血小板凝结，抗癌，抗炎，抗福射，抗衰老，防治屯、血管疾病 等。它与紫杉醇都被誉为绿色抗癌药物。但自然界中存在的白襲芦醇的含量较少，利用植物 基因工程技术高效生产白襲芦醇是大量获得白襲芦醇的重要途径。
[0003] 白襲芦醇广泛存在于种子植物中，作为巧类次生代谢物，主要通过苯丙氨酸代谢 途径合成的。刘蕾等克隆了白襲芦醇合酶cDNA，并将其转化花生的下胚轴、胡萝h的下胚轴； 同时，也把花生RESS转化酵母。许玉芬等成功构建了花生白襲芦醇合酶基因的酵母表达载 体，并通过电穿孔法将其整合到毕赤酵母的染色体上;成功构建了由化i启动子驱动的花生 白襲芦醇合酶基因单子叶植物表达载体，分别利用农杆菌介导和基因枪转化法转导甘薦。 黄国强等研究了白襲芦醇合酶基因在花生根中的特异表达，研究结果表明：该基因的转录 表达在根的初皮部，其他组织中未见表达;酵母浸提液处理可使该基因的转录表达明显增 强。林荣华等W花生中的白襲芦醇合酶基因为目的基因，构建了含目的基因的植物重组表 达载体地6RS，利用电穿孔法将PB6RS质粒直接导入根癌农杆菌LBA4404中，通过农杆菌介导 将地6RS转化烟草(云烟85)，得到了阳性植株。
[0004] 由于白襲芦醇的重要生理功能，近几年，人们开始研究利用生物技术提高植物材 料中白襲芦醇的含量。Giovinazzo等研究者W35S启动子调控白襲芦醇合酶基因进行番茄 遗传转化，测定转基因番茄中的抗坏血酸盐与谷脫甘肤还原酶的总体水平，结果表明：转基 因植物的抗氧化性较之野生型植物的抗氧化性有了显著的提高。册sken等利用油菜种子特 异表达启动子驱动白襲芦醇合酶基因表达，转化油菜，同时，阻断消耗白襲芦醇合酶底物的 另一条支路，检测To代油菜种巧中的Res含量，发现W鲜重计其最高含量为361 yg/g，同时 还获得了品质改善且保健性提高的油菜种巧。但目前，通过根特异启动子驱动白襲芦醇合 酶基因表达生产白襲芦醇的研究未见报道。
[000引发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)是一种革兰氏阴性±壤细菌，它能够侵 染大多数双子叶植物和少数单子叶植物及裸子植物，诱导植物产生发状根(毛状根）。发状 根相对于正常的根，有很多优点。理论上，发状根来源于一个植物细胞，不是嵌合体，所W其 遗传性状稳定，继代多次仍然具有原始发状根的遗传特性;发状根能够在无外源激素的培 养基中自主生长，且生长速度快，易操作和调控，不受季节和地域限制;某些次生代谢产物 在发状根中含量比正常根高。因此，利用发状根生产次生代谢产物是一条可靠和有效的途 径。
[0006] 在花生各组织中，白襲芦醇W根中的含量最高。因此，快速获得大量根，既获得了 植源性的白襲芦醇材料，进而可W大量提取白襲芦醇。而发根农杆菌可W侵染植物，在伤口 处形成发状根，且发状根无激素依赖性，又可W快速生长，在短时间内增长数百倍甚至上千 倍。基于此，W发状根液体培养是快速大量生产白襲芦醇的一条捷径。刘杰等优化了发状根 的培养条件，并初步探索了诱导发状根产生白襲芦醇的条件，研究结果表明：花生发根的最 适基本液体培养基为无激素的MS培养基，添加植物激素会不同程度的抑制发状根的生长， 100 ymol/L水杨酸(SA)可W提高花生发状根白襲芦醇巧合成分泌W及白襲芦醇的合成。 黄丽萍等探究了不同发根农杆菌转化不同品种烟草发根效率的差异，结果表明：不同烟草 品种和发根农杆菌菌株均显著影响毛状根的诱导率。Fabricio等研究发现，花生发状根可 W高效产生白襲芦醇，不同生长阶段的发状根诱导产生白襲芦醇含量不同，且在合适的生 长阶段，一定浓度的醋酸钢诱导发状根24 h，白襲芦醇会被分泌到液体培养基中。但目前， 通过根特异启动子驱动白襲芦醇合酶基因在花生发状根表达生产白襲芦醇的研究未见报 道。
[0007] 本发明针对W上研究背景，利用发根农杆菌介导pBI121-NtR12-AhRESS遗传转化 花生，获得根特异启动子化R12驱动AhRESS表达的转基因花生发状根，通过发状根液体悬浮 培养，快速大量获得发状根，进而用于白襲芦醇的生产。该发明为利用烟草根特异启动子 NtR12驱动花生白襲芦醇合酶基因 AhRESS在花生发状根中特异表达，进而生产白襲芦醇提 供了良好的基础。
【发明内容】
[0008] 本发明提供了一种烟草根特异启动子化R12驱动AhRESS在花生发状根系大量合成 白襲芦醇的技术及应用。目的在于提供烟草根特异启动子化R12驱动花生白襲芦醇合酶基 因 AhRESS在花生发状根中特异表达，进而生产白襲芦醇的技术，W便利用植物基因工程手 段高效生产白襲芦醇。本发明用烟草根特异表达启动子驱动花生白襲芦醇基因，构建了 地I121-NtR12-AhRESS根特异表达载体，采用多次冻融法把载体导入发根农杆菌，通过农杆 菌介导，把融合基因化R12:AhRESS整合到本生烟草基因组，获得了同时表达发状根基因和 AhRESS基因的花生发状根生产系，建立了发状根液体悬浮培养技术，快速获得大量发状根， 进而用于白襲芦醇的生产。实现了本生烟草发状根生产白襲芦醇。
[0009] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案： 特异启动子化R12驱动AhRESS在花生发状根系产白襲芦醇的方法，包括W下步骤： (1) 克隆烟草根特异启动子化R12和花生AhRESS基因； (2) 烟草根特异启动子化R12驱动花生白襲芦醇合酶基因 AhRESS表达载体PBI121- NtR12-AhRESS 的构建； (3) 地I121-NtR12-AhRESS经发根农杆菌介导转化花生； (4) 转地1121-NtR12-AhRESS花生发状根液体悬浮培养； 巧)转地I121-NtR12-AhRESS花生发状根白襲芦醇含量的检测。
[0010] 所述步骤（1)中pBI121-NtR12-AhRESS载体中烟草根特异启动子化R12的序列为 沈Q ID No: 1，花生AhRESS基因的序列为沈Q ID No:2。
[0011] 所述步骤(3)中发根农杆菌介导的花生遗传转化外植体分别为叶片、子叶、上胚轴 和下胚轴外植体。
[0012] 所述步骤(4)中转pBI121-NtR12-AhRESS花生发状根液体悬浮培养所用培养基为 MS培养基巧00 mg/L Cef，第一次继代培养基为MS培养基+300 mg/L Cef，第二次继代培养 基为MS培养基+100 mg/L Cef，第Ξ次继代培养基为MS培养基;Ξ次继代后头抱霉素浓度降 至0;获得了根特异表达启动子化R12驱动花生白襲芦醇基因表达生产白襲芦醇的根系快速 繁殖生产系。
[001引所述步骤巧）中转pBI121-NtR12-AhRESS花生发状根白襲芦醇含量的检测方法为 HPLC，色谱条件为:色谱柱0DS (250 mmX4.6 mmX5皿），流动相乙腊:水(25:75)，流速 1.0 mL/min，检测波长306 nm，柱溫25°C，进样量10化。
[0014]具体包括W下步骤： 1.烟草根特异启动子化R12驱动花生白襲芦醇合酶基因 AhRESS表达载体PBI121- NtR12-AhRESS 的构建。
[001引 （1)克隆烟草根特异启动子NtR12,并连接至PMD18-T载体中，得到pMD18-NtR12载 体； (2 ) pB 1121 -NtR 12-GUSA载体构建:利用限制性内切酶BamHI及Sac I对pB 1121质粒载体 进行酶切，切除该载体上的GUSA基因，利用带有限制性酶切位点的特异引物从PCAMBIA1301 载体中克隆GUSA基因，连接至酶切后的pB1121载体上，得到pB1121-GUSA载体;将pB1121 - GUSA载体进行酶切反应，切除35S启动子，将pMD18-NtR12载体进行酶切反应，将化R12启动 子连接至地1121 -GUSA载体中，得到地1121 -NtRl 2-GUSA载体； (3)pBI121-NtR12-AhRESS载体的构建:克隆花生白襲芦醇合酶基因 AhRESS基因，并连 接到地1121 -NtRl 2-GUSA载体中，得到地1121 -NtR2-AhRESS载体。
[0016] 2.烟草根特异启动子化R12驱动花生白襲芦醇合酶基因 AhRESS表达载体地1121- NtR12-AhRESS经发根农杆菌介导转化花生。
[0017] 在发根农杆菌诱导植物产生发状根的基础上，利用pBI121-NtR12-AhRESS载体转 化发根农杆菌，通过其介导遗传转化花生，获得转基因花生发状根。W CTAB法提取转基因花 生及对照的发状根的DNA，分别WAhRESS基因（AhRESS-F: 5 ' ATGGTGTCTGTGAGTGGAATTC3 ' 和 AhRESS-R： 5 ' T