TATATGGCCACACTGCGGAGAAC 3'）和rol B 基因 （rol B-F:5' GTCCTTGCAGTGCTAGATTT 3 ' 和rol B-R: 5 ' GAAGGTGCAAGCTACCTCTC3 '）的上、下游引物进行 PCR;WCTAB法提取转基因花生及对照的发状根的RNA，按照PrimeScript逆转录酶说明书逆 转录后，WAhRESS基因特异引物(AhRESS-F: 5 ' ATGGTGTCTGTGAGTGGAATTC3 ' 和AhRESS-R: 5 ' TTATATGGCCACACTGCGGAGAAC 3'）进行RT-PCR，PCR反应条件为：94°C 5 min一（94°C 30 S一 57°C 30 S一72°C 1.5 min)35巧cles一72°C 10 min一4°C保存。。筛选阳性发状根进行下 一步实验。
[0018] 3.转地I121-NtR12-AhRESS花生发状根液体悬浮培养。
[0019] 通过液体MS培养基的培养，继代时逐渐降低Cef的浓度，直至最后Cef降至0而发状 根在纯液体MS培养基中可W快速生长又不受污染。需要注意的是，外植体不同位点长出的 根为不同的发状根系，除菌时要W1条根起始。发状根快速扩繁即将一条发状根接种于新鲜 MS培养基中，28°C振荡暗培养2周，发状根产量是接种量的100倍W上。筛选所得的能够快速 生长的转基因花生发状根液体培养后，收获发状根。
[0020] 4.转地I121-NtR12-AhRESS花生发状根白襲芦醇含量的检测。
[0021] W甲醇为浸提液提取发状根中白襲芦醇，浸提液经旋转蒸发浓缩得HPLC待检测样 品，通过HPLC测定发状根中白襲芦醇含量。
[0022] 有益效果 本发明利用烟草根特异启动子化R12驱动AhRESS基因在烟草根中特异表达，将植物表 达载体经发根农杆菌转化至花生中，使AhRESS基因在花生发状根中特异表达，通过液体悬 浮培养短期内大量扩繁发状根，实现白襲芦醇的大量表达。本发明的转基因花生发状根培 养简单、生长快速、遗传性状稳定，可为利用植物基因工程手段高效生产白襲芦醇提供基 础。利用有机溶剂浸提法提取转基因花生发状根中白襲芦醇，经高效液相色谱(HPLC)测定， 其白襲芦醇含量最高为80.9化g/g(FW)，是未转基因发状根中白襲芦醇含量的4倍。
【附图说明】
[0023] 图1发根农杆菌介导的pBI121-NtR12-AhRESS遗传转化花生外植体诱导发状根的 变化图；.A:诱导1周，B:诱导2周。
[0024] 图2转基因花生发状根系中AhRESS基因 RT-PCR检测电泳图；M:Marker 2000,1- 12:转地1121 -NtRl 2-AhRESS发状根系，13:阳性对照，14:阴性对照. 图3转基因花生发状根系液体悬浮培养图;A:接种，B:培养1周，C:培养2周。
[0025] 图4转基因花生发状根系中白襲芦醇HPLC分析结果。XH:新会小粒根，PTP:葡萄皮， A.r:阴性发状根，12-(4,7):地I121-NtR12-AhRESS发状根系。
【具体实施方式】
[0026 ]【实施例1】地1121 -NtRl 2-AhRESS载体的构建 1.烟草根特异启动子化R12的克隆 称取约0.1 g烟草叶片，置于研鉢中用液氮冻融，迅速将其研磨成粉末;利用CTAB法提取 烟草中的DNA，用4化LWngAiL的RNase无菌水溶解，置于37°C溶解化左右。取化L提取好的烟 草DNA点样，进行电泳检测，电泳条件：电泳缓冲液1 X TAE，1.0%的琼脂糖凝胶，电压120V，电 泳时间约20min;同时取化L用紫外分光光度计测定其浓度。
[0027] 根据本实验室前期克隆获得的化R12启动子的拼接序列，设计引物化R12-XhoI- primer-F(5'GCGCCGCTCGAGTAATACTACAATAATAATTAAG 3'），化R12- XbaI-primer-R(5' CGCTCTAGAGTTGTTGATATGTTTATGTTACTC 3'），按照下列的PCR体系进行扩增。该体系包括 32.化Ld地20，10μL10XPrimeSTARPCRBuffer(Mg2+plus)，4化dNTPMixture(各 2.5mmol)，：LyL 化RIS-XhoI-primer-F (10μηιο1)，：?μΙ 化R12- XbaI-p;rime;r-R(10ymol)，ly L 烟草〇0臟，0.5化 Prime STAR 服 DNA polymerase (2.5 υ/μL )，体系总体积为50化。
[0028] 将50化的PCR反应体系混匀，均分为2管，每管各25化。PCR反应条件为:98°C 5min 一（98°C 10s一53°C 15s一72°C 2mir〇5cycles一（98°C 10s一60°C 15s一72°C 2min) 23巧cles一72°C lOmin一4°C保存。
[0029] PCR产物经琼脂糖凝胶电泳回收纯化后，连接至pMDlS-T Vector中，体系如下：5化 Solution 1,4.扣L DNA回收产物，0.5化PMD18-T Vector巧Ong/化），该体系总体积10化。 将各成分分别加入2(Κ)化的PCR管中，混匀，16°C过夜连接，约16-24h。将连接产物转化大肠 杆菌感受态细胞DH5a中，摇菌后涂于含抗生素 Amp的LB平板上，于37°C恒溫培养箱中培养 12-16h。挑取单克隆经PCR检测后送往华大基因进行测序，测序结果如SEQ ID N0.1。测序结 果正确的重组质粒即为pMD18-NtR12。
[0030] 2.花生白襲芦醇合酶基因 AhRESS的克隆 利用CTAB法提取花生叶片基因组DNA，W花生白襲芦醇合酶基因特异引物4}11?655- BamHI-primer-F( 5' TCGTGGATCCGCCACCATGGTGTCTGTGAGTGG AATTC 3'），AhRESS-SacI- primer-lK5' TCCTGAGCTCTTATATGGCCACACTGCG GAGAACG 3'）进行PCR检测。其回收产物即 为花生AhRESS基因编码框DNA序列。通过连接酶构建在pMDlS-T载体中，转入大肠杆菌感受 态细胞D册α中，挑选阳性克隆进行测序鉴定，测序结果如SEQ ID NO.2。
[0031 ] 3.地I121-GUSA载体的构建 WpCAMBIA-1301载体质粒为模板，用带有限制性酶切位点的特异引物化1154。-8曰111护 Spe : 5 ' agga-GGATCC-ACTAGTaccatggtagatctgaggg taaatttc 3 ' 和611541?-5日(31-45〔1- Swal: 5'agga-gagctc-GGCGCGCCTAAATTTA-GAAATTCGAGCTGGTCACCTGT 3'）进行PCR，其回收 产物即为克隆得到的GUSA基因。将pBI 121载体利用BamH巧日SacI进行酶切，切除该载体上的 GUSA基因，回收酶切后的载体条带；将GUSA基因连接至酶切后的PBI121载体上，得到 地I121-GUSA 载体。
[0032] 4.地I121-NtR12-AhRESS载体的构建 将pMD 18-NtRl 2载体利用限制性内切酶Sac I和BamHI进行酶切，酶切体系如下：2. Oyg质 粒DNA，5.0化10XKbuffer，2.0μLSacI，2.0化BamHI，d地20补至50化，混匀，于37°C消化 酶切10-1化，反应结束后用琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果，回收目的条带，获得NtR12启动 子。
[0033] 利用限制性内切酶Sac巧邮amHI将PBI121-GUSA载体进行酶切，切除35S启动子，酶 切体系如下：2.0μg质粒DNA，5.0化10XKbuffer，2.0μLSacI，2.0化BamHI，d地20补至50 yL，混匀，于37°C消化酶切1化，反应结束后用琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果。
[0034] 将化R12启动子连接至切除35S启动子的PBI121-GUSA载体中，连接反应体系如下： Ι.ΟμΙ 10XT4ligase buffer,4.0化基因 DNA片段，4.0化载体DNA片段，1.0化 T4 DNA ligase，混匀，于16°C过夜连接。将连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，菌液涂布于含 抗生素 Kan的LB平板上，于37°C恒溫培养箱中培养14h。
[003引挑取单克隆进行菌液PCR检测，PCR反应体系如下：1.0化模板，2.0化10XPCR buffe;r，1.5yL 2.5mM dNTP，0.1 化普通Taq酶，0.5化 NtR12- XhoI-primer-F'O.SliL 化尺12-乂6日1可'山6'-3，14.4化(1地20。？0?反应条件为：94。05111111一（94。0303一53。0303 一72°C 2min巧巧cles一（94°C 30s一60°C 30s一72°C 2min)30巧cles一72°C lOmin一4°C 保存。对菌液PCR呈阳性的部分菌液进行扩繁，用碱裂解法提取质粒，然