双基因表达载体及其应用
【技术领域】
[0001 ] 本发明设及从PCAMBIA3301-ACTIN2: :3址A-LUC改造的Ξ个双基因表达植物载体- pDTl、pDT7和pDT7G。
【背景技术】
[0002] 转基因植株的构建是现代植物生物学非常重要的先决条件。而载体作为外源基因 进入目标植物的基因组的转运者，在转基因植株的生成方面扮演着非常重要的角色。然而 随着研究人员对多个蛋白之间关系W及多基因共同控制植物生长发育研究的需要，尤其是 多蛋白的相互作用，W前的单基因载体已经不能满足现在的需要。所W研究人员需要一种 高效的方法来转化多基因进入植物内W获得同时表达多个基因的转基因植株。
[0003] 目前，传统的获得多基因转基因植株的方法包括共转化，再转化W及杂交。但是运 些传统方法的缺点是共转化的两个或多个基因的转化效率是不可控的，每个基因在目标基 因组的插入位置也是不一样的，而基因分离会导致不稳定的遗传后代。另外再转化W及杂 交都是耗时的过程。
[0004] 而为了克服运些缺点，具有单个或者多个转录盒子的多基因载体应运而生并成功 应用于多个研究，但是运些多基因表达载体的应用没有得到广泛的推广应用。因为大部分 的方法需要亚克隆W至于克隆所耗时间拉长;没有标签或者报告基因与目标基因相连，运 样就导致蛋白或者基因的鉴定比较困难；另外，某些方法如采用同尾酶构建多基因载体的 方法受限于可用的酶的数量不多运个问题。所W构建多基因载体需要根据研究目的而设 计。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供Ξ个可表达双基因的植物表达载体，该系列载 体改造自PCAMBIA3301-ACTIN2: : 3XHA-LUC(该载体由中国农业科学院刘斌教授实验室赠 送，本发明人实验室保存），可简单快速、可靠、高效用于双基因的表达及其转基因植物的构 建。
[0006] 本发明提供的技术方案是:Ξ个能用于双基因表达的植物表达载体，所述载体为 PCAMBIA3301-ACTIN2: : 3址A-LUC改造而来，编号为pDTl、pDT7和pDT7G，具体如下：一种双基 因植物表达载体，改造自PCAMBIA3301-ACTIN2: : 3址A-LUC，其具有Ξ个独立的转录单位，其 中一个是在由35S启动子控制的bar基因转录单位，一个是由ACTIN2启动子控制的标签蛋白 my C基因的转录单位，和一个是由UBQ10启动子控制的标签蛋白HA基因的转录单位。
[0007] 所述的双基因植物表达载体，所述载体的线性结构如图1A所示。
[000引上述的双基因植物表达载体，所述载体构建过程如下：
[0009] (1)准备好骨架载体PCAMBIA3301-ACTIN2: : 3XHA-LUC和克隆目标片段所需要的载 体W及DNA;
[0010] (2)设计适合in-fusion克隆的含接头的引物；
[0011] (3)从骨架pCAMBIA3301-ACTIN2::3xHA-LUC克隆3xHA片段，pGARD-Myc上克隆 4xmyc片段，PKYLX-CRY2-GR上克隆6址i s-cGR片段，其中6址i s已合成在引物上，P邸8上克隆 Tnos；
[0012] (4)用SpeI&BamHI酶切pCAMBIA3301-ACTIN2::3xHA-LUC，去掉3址A-LUC，并用In- fusion酶连接4xmyc片段至该酶切后的载体上，即为中间载体pCAMBIA3301-ACTIN2:: 4xmyc；
[OOU] (5)将UBQIO启动子序列与3xHA片段通过引物设计加入的ASC I酶切位点并用Τ4连 接酶桥连接成UBQ10::3xHA片段，所述片段的两段都通过引物设计在UBQ10启动子序列的5' 加入了AvrII，在3xHA的3'加入了MfeI、Aat II、化C 巧P化0 I;
[0014] (6)用Pst I酶切中间载体PCAMBIA3301-ACTIN2: :4xmyc，用In-fusion的方法连接 册910::3义齡至该酶切后的载体上，即为中间载体口〔施8^3301-4口'1肥：：]?7(3-了355-册910:: HA；
[0015] (7)用化C I和化0 I酶切(6)中的中间载体，用In-化Sion酶无缝连接Tnos片段至酶 切后的载体上，即为最终的载体pDTl (PCAMBIA3301-ACTIN2: :Myc-T3日S-UBQ10: :HA-Tnos)。
[0016] 另一种双基因植物表达载体，改造自9〔418^3301-4圳1肥：：3址4-〇](：，具有^个 独立的转录单位，其中一个由35S启动子控制的bar基因转录单位，一个由ACTIN2启动子控 审揃标签蛋白my C基因的转录单位，和一个由UBQ10启动子控制的串联标签Hi s-cGR基因的 转录单位，其中cGR是鼠糖皮质激素蛋白508到795的氨基酸残基，具有地塞米松依赖的核质 转移功能。
[0017] 所述的双基因植物表达载体，所述载体的线性结构如图1B所示。
[0018] 所述的双基因植物表达载体，所述载体构建过程如下：
[0019](1)准备好骨架载体9〔施8143301-4(：1'1肥：：3义齡-〇]巧日克隆目标片段所需要的载 体W及DNA;
[0020] (2)设计适合in-fusion克隆的含接头的引物；
[0021] (3)从骨架pCAMBIA3301-ACTIN2::3xHA-LUC克隆3xHA片段，pGARD-Myc上克隆 4xmyc片段，PKYLX-CRY2-GR上克隆6xHis-cGR片段（6xHis已合成在引物上），PER8上克隆 Tnos；
[0022] (4)用SpeI&BamHI酶切pCAMBIA3301-ACTIN2::3xHA-LUC，去掉3址A-LUC，并用In- fusion酶连接4xmyc片段至该酶切后的载体上，即为中间载体pCAMBIA3301-ACTIN2:: 4xmyc；
[0023] (5)将UBQIO启动子序列与6姐is-cGR片段通过引物设计加入的ASC I酶切位点并 用T4连接酶桥连接成UBQ10::6xHis-cGR片段，所述片段的两段都通过引物设计在UBQ10启 动子序列的5'加入了AvrII，在3xHA和6址is-cGR的3'加入了MfeI、Aat II、Pac巧日化0 I;
[0024] (6)用Pst I酶切中间载体PCAMBIA3301-ACTIN2: :4xmyc，用In-fusion的方法连接 UBQ10: :6xHis-cGR至该酶切后的载体上，即为中间载体口〔48143301-4(：1'^2::]\17。-了355- UBQ10::His-cGR；
[00巧](7)用化C I和化0 I酶切(6)中的中间载体，用In-化Sion酶无缝连接Tnos片段至酶 切后的载体上，即为最终的载体pDT7(pCABIA3301-ACTIN2: :Myc-T35s-UBQ10: :His-cGR- Tnos)。
[0026] 另一种双基因植物表达载体，改造自PCAMBIA3301-ACTIN2: :3址A-LUC，其是在上 述的双基因表达载体的基础上，引入来自于果蛹的Gypsy绝缘子序列，该绝缘子Gypsy序列 反向相对的在如权利要求4所述的双基因表达载体第二个转录单位的左侧已经第Ξ个转录 单位的右侧W此消除位置效应保证启动子的特异性转录控制；并将6xHis序列替换为 3xFlag 序列。
[0027] 所述的双基因植物表达载体，所述载体的线性结构如图1C所示。
[0028] 所述的双基因植物表达载体，所述载体构建过程如下：
[0029] (1)上述的双基因植物表达载体6614nt和8178nt之间的片段被克隆下，并另外将 该片段用Κρη I从权利要求6所述双基因表达载体上酶切去掉，并纯化回收大片段；
[0030] (2)从载体上克隆正向和反向Gypsy绝缘子序列；
[0031] (3)用（1)中克隆出的片段的正向引物和(2)中Gypsy片段的反向引物，W运两个片 段的混合物作为模板进行克隆；
[0032] (4)将(3)中克隆到的桥接片段通过T4连接酶连接到（1)中已用Κρη I酶切的所述 载体；
[0033] (5)将反向Gypsy序列连接至(4)中已经连接了正向Gypsy序列并用化0 I酶切的载 体上；
[0034] (6)将巧）中改造后的PDT7ASC巧日Aat II之间的序列克隆下来并构建到pGWC(T载 体)上，然后将1 l〇95nt位置的叩'克隆突变成W去掉一个化i I酶切位点(ATGCAT，11090 ~1109化P)，最后用化i I和Nde I将6址is序列片段从T载体上酶切去掉；
[00巧](7)3xFlag片段通过合成单链ssDNA后，退火成双链DNA，连接至化i巧日Nde I酶切 后的T载体上；
[0036] (8)用Asc I和Aat II将T载体上改造后的序列酶切下来，并连接到用运两个酶酶 切后的pDT7上，最终即为PDT7G。
[0037] 同时，本发明还提供双基因载体在植物中表达双基因的应用:将TCP2与CRY1的CDS 分别克隆到pDTl的Spe I和Mef I酶切位点构建TCP2-CRY1-PDT1载体，通过农杆菌介导转染 法转入拟南芥和烟草中。此外还构建了 TCP2-Myc-pDTl和HA-CRYl-pDTl单个基因载体作为 对照转入了烟草中。通过免疫印迹检巧UTCP2和CRY1在拟南芥和烟草中的表达。
[003引用同样的方式分别构建CRY1-TCP2-PDT7和CIB1-B7-PDT7 (B7: AT2G02320)。并将运 两个载体转入拟南芥中，得到草甘麟抗性的拟南芥转基因植株，然后对草甘麟抗性植株进 行免疫印迹和实时定量PCR检测双基因的表达。
[0039] 将一对基因 A-BW及LUC-GFP构建到PDT7G载体上，得到如下重组载体:A-B-pDT7G、 LUC-GFP-PDT7G和GFP-LUC-pDT7GdA-B-pDT7G转入拟南芥中后进行免疫印迹检测。将LUC- GFP-PDT7G和GFP-LUC-PDT7G转入烟草叶片细胞中，瞬时表达LUC和GFP蛋白。进行巧光霉素 检测实验（luciferase assay)检测LUC蛋白的表达和巧光显微镜试验观察GFP的表达位置。
[0040] 在T