异戊二烯合酶和其编码基因以及用于产生异戊二烯单体的方法

异戊二烯合酶和其编码基因以及用于产生异戊二烯单体的方法
【专利摘要】本发明提供了用于建立优良的异戊二烯单体产生系统的方法。具体地，本发明提供了以下(a)、(b)或(c)的多核苷酸及其类似物：(a)多核苷酸，包含(i)由SEQ ID NO:1所代表的核苷酸序列，或(ii)由SEQ ID NO:1所代表的核苷酸序列中的第133位至第1785位的核苷酸残基组成的核苷酸序列；(b)多核苷酸，包含与以上的(i)或(ii)的核苷酸序列具有90％或更高同一性的核苷酸序列，且该多核苷酸编码具有异戊二烯合酶活性的蛋白质；或(c)多核苷酸，其与由和以上(i)或(ii)的核苷酸序列互补的核苷酸序列组成的多核苷酸在严格条件下杂交，且该多核苷酸编码具有异戊二烯合酶活性的蛋白质。
【专利说明】异戊二烯合酶和其编码基因以及用于产生异戊二烯单体的 方法

【技术领域】
[0001] 本发明涉及异戊二烯合酶和编码其的基因，以及类似物。

【背景技术】
[0002] 天然橡胶是轮胎和橡胶工业中非常重要的原材料。而主要由于新兴国家中的动力 化，将在未来加大对其的需求，鉴于对森林砍伐的规定和棕榈的竞争，增加农场是不易的， 且难以期望天然橡胶产量的增加。因此，供需平衡将变得紧张。合成的聚异戊二烯作为替换 天然橡胶的材料是可获得的。其原料单体（异戊二烯（2-甲基-1，3-丁二烯））主要通过 从获自石脑油裂化的C5成分提取而获得。然而，在近几年，随着轻质油裂化物的使用，产生 的异戊二烯的量倾向于降低，其供给成为问题。并且在近几年中，由于油价变化的极大影响 需要建立源自非油来源经济地产生异戊二烯的系统，以稳定地保证异戊二烯单体的供给。
[0003] 考虑到该需求，已公开了利用转化体产生异戊二烯单体的方法，该转化体通过将 异戊二烯合酶基因及其源自分离的野葛或杨树的突变体导入到微生物中以用于发酵生产 而获得（参见，专利文献1和2)。
[0004] 现有技术文献
[0005] 专利文献
[0006] 专利文献I JP公开第2011-505841号
[0007] 专利文献2 JP公开第2011-518564号
[0008] 非专利文献
[0009] 非专利文献 I :Kesselmeier J.等人，Journal of Atmospheric Chemistry,卷 33,第 23-88 页，1999。
[0010] 非专利文献 2 :Monson R. Κ·等人、plant Physiol.，卷 98，第 1175-1180 页，1992。
[0011] 非专利文献 3 :Kuzma J.等人、plant Physiol.，卷 101，第 435-440 页，1993。


【发明内容】

[0012] 本发明所解决的问题
[0013] 然而，专利文献1和2中所描述的异戊二烯合酶的酶活性低，且当使用这些异戊二 稀合酶基因时，关于以商生广力广生异戊-稀仍存在提升空间。
[0014] 本发明鉴于以上情形而产生，且本发明的目的是提供用于建立优良的异戊二烯单 体产生系统的方法。
[0015] 解决问题的方法
[0016] 作为用于解决以上问题的大量研究的结果，本发明已发现源自黧豆（黧豆 (Mucuna pruriens))的异戊二烯合酶具有产生异戊二烯单体的优良的能力，并且实现了本 发明。
[0017] 因此，本发明为如下所述。
[0018] [1]以下（a)、（b)或（c)的多核苷酸：
[0019] (a)多核苷酸，包含⑴由SEQ ID NO: 1所代表的核苷酸序列，或（ii)由SEQ ID NO: 1所代表的核苷酸序列中的第133位至第1785位的核苷酸残基所组成的核苷酸序列；
[0020] (b)多核苷酸，包含与以上的⑴或（ii)的核苷酸序列具有90%或更高同一性的 核苷酸序列，且该多核苷酸编码具有异戊二烯合酶活性的蛋白质；或
[0021] (C)多核苷酸，其与由和以上⑴或（ii)的核苷酸序列互补的核苷酸序列组成的 多核苷酸在严格条件下杂交，且该多核苷酸编码具有异戊二烯合酶活性的蛋白质。
[0022] [2]根据[1]的多核苷酸其中所述多核苷酸来源于黧豆。
[0023] [3]以下（A)、⑶或（C)的蛋白质：
[0024] ㈧蛋白质，包含（i'）由SEQ ID NO: 2代表的全长氨基酸序列，或（ii'）由SEQ OD N0:2代表的氨基酸序列中的第45位至第594位处的氨基酸残基组成的氨基酸序列；
[0025] (B)蛋白质，包含与（i'）或（ii'）的氨基酸序列具有90%或更高同一性的氨基酸 序列，且该蛋白质具有异戊二烯合酶活性；或
[0026] (C)蛋白质，包含在（i'）或（ii'）的氨基酸序列中具有一个或若干个氨基酸的缺 失、置换、添加或插入的氨基酸序列，且该蛋白质具有异戊二烯合酶活性。
[0027] [4]表达载体，包含根据[1]或[2]的多核苷酸，或包含编码根据[3]的蛋白质的 多核苷酸。
[0028] [5]转化体，通过将根据[4]的表达载体导入到宿主中而制备。
[0029] [6]根据[5]的转化体，其中所述宿主具有经由甲基赤藓醇磷酸盐途径合成二甲 基丙烯基二磷酸盐的能力。
[0030] [7]根据[6]的转化体，其中所述宿主是大肠杆菌（Escherichia coli)。
[0031] [8]根据[5]至[7]中任一项的转化体，其中所述转化体具有经由甲羟戊酸途径和 甲基赤藓醇磷酸盐途径合成二甲基丙烯基二磷酸盐的能力。
[0032] [9]根据[5]的转化体，其中所述宿主是属于棒状杆菌（Corynebacterium)属、泛 菌（Pantoea)属、肠杆菌（Enterobacter)属或酵母菌（Saccharomyces)属的微生物。
[0033] [10] -种产生根据[3]的蛋白质的方法，包括利用根据[5]至[9]中任一项的转 化体形成根据[3]的蛋白质。
[0034] [11] 一种产生异戊二烯单体的方法，包括在根据[3]的蛋白质的存在下从二甲基 丙烯基二磷酸盐形成异戊二烯单体。
[0035] [12]根据[11]的方法，其中通过培养根据[5]至[9]中任一项的转化体形成异戊 二烯单体。
[0036] [13]根据[12]的方法，其中通过培养转化体从培养基中的碳源供给二甲基丙烯 基二磷酸盐。
[0037] [14] -种产生异戊二烯聚合物的方法，包括（I)和（II):
[0038] (I)通过根据[11]至[13]中任一项所述的方法形成异戊二烯单体；和
[0039] (II)使异戊二烯单体聚合以形成异戊二烯聚合物。
[0040] 发明的效果
[0041] 根据本发明，可能建立优良的异戊二烯单体产生系统。
[0042] 附图简述
[0043] 图1是显示每单位重量的来自不同植物的干叶产生的异戊二烯的量的图；
[0044] 图2是显示每从不同植物的叶提取的总蛋白质的量产生的异戊二烯的量；
[0045] 图3是显示固定的染色体上的甲羟戊酸途径的下游及其邻近区域的示意图的概 图；和
[0046] 图4是显示固定的染色体上的由tac启动子控制的甲羟戊酸途径的下游及其邻近 区域的概图。
[0047] 实现本发明的实施方案
[0048]〈编码异戊二烯合酶的多核苷酸〉
[0049] 本发明提供了编码异戊二烯合酶的多核苷酸。
[0050] 异戊二烯合酶是将二甲基丙烯基二磷酸盐转化为异戊二烯的酶。发明人首先在 高温下在相同的条件下在不同的植物中评估了产生异戊二烯的能力。结果，发现黧豆（黧 豆）产生异戊二烯的能力比杨属植物（钻天杨（Populus nigra var. italic))和葛藤（野 葛（Pueraria Iobata))产生异戊二烯的能力高几倍到几十倍。然而，该产生异戊二烯的高 能力是否归因于植物产生二甲基丙烯基二磷酸盐的能力的高能力、植物的异戊二烯合酶的 高产或植物具有的高酶比活性尚不清楚。特别地，在非专利文献2和3中，Monson和Kuzma 等人利用由硫酸铵分级分离部分地纯化的酶检查了黧豆中的异戊二烯合酶活性的PH依赖 性和其他性质，但黧豆中的比活性是否高于杨属植物或葛藤并不清楚。因此，发明人通过硫 酸铵分级分离从杨属植物和葛藤中部分地纯化了异戊二烯合酶，并检查了粗提溶液的比活 性。结果，发现源自黧豆的异戊二烯合酶的比活性比源自葛藤的异戊二烯合酶高几倍到几 十倍。还证明了所测量的来自黧豆的异戊二烯合酶的比活性比来自专利文献1和2中所报 道的杨树中的粗酶中的一的比活性高数十倍。基于以上，显示了黧豆潜在地具有高功能的 异戊二烯合酶。
[0051] 因此，分析了来自黧豆的异戊二烯合酶基因的核苷酸序列。以下将描述分析方法 的一个例子。
[0052] 已知异戊二烯合酶仅在植物的叶中表达，且在强光和高温下其表达水平增加。因 此，首先从黧豆的叶中提取了总RNA，其中在40°C的温度下在光照下又到了异戊二烯合酶 mRNA的转录。确认了所提取的总RNA未分解且未被基因组DNA所污染。然后，将总RNA转 化为双链并破碎，利用高效测序仪仅分析在3'端具有聚腺苷酸序列的核苷酸序列。组装重 叠的序列以获得多个重叠群序列。对于这些重叠群序列进行BLAST检索，并检测了与来自 野葛和杨树的已知异戊二烯合酶基因的已登记的序列具有同源性（核苷酸序列的同一性） 的重叠群序列，并获得了来自黧豆的异戊二烯合酶基因的部分序列。基于该部分序列，利用 标准方法进行5'RACE(cDNA末端的快速扩增）以分析来自黧豆的异戊二烯合酶基因的全场 核苷酸序列，其由SEQ ID NO: 1所代表。
[0053] 可获得来自黧豆的异戊二烯合酶的cDNA，例如通过RT-PCR，利用以上所获得的总 RNA作为模板，利用基于来自黧豆的异戊二烯合酶基因的经分析的核苷酸序列信息设计的 引物来获得。
[0054] 在一个实施方案中，本发明的多核苷酸是包含以下的多核苷酸：（i)由SEQ ID NO: 1所代表的核苷酸序列，或（ii)由SEQ ID NO: 1所代表的核苷酸序列中的第133位至 第1785位的核苷酸残基所组成的核苷酸序列。由SEQ ID NO: 1所代表的核苷酸序列可编 码由SEQ ID N0:2所代表的氨基酸序列，由第1位至第132位的核苷酸残基组成的核苷酸 序列可编码推测的叶绿体定位信号，且由第133位至第1785位的核苷酸残基组成的核苷酸 序列可编码成熟的异戊二烯合酶的氨基酸序列。
[0055] 在另一个实施方案中，本发明的多核苷酸是包含与以上（i)或（ii)的核苷酸序 列具有90%或更高同一性的核苷酸序列的多核苷酸，且该多核苷酸编码具有异戊二烯合酶 活性的蛋白质。与核苷酸序列的百分比同一性可以是 97%、98%或99%或更高。异戊二烯合酶活性指从二甲基丙烯基二磷酸盐（DMAPP)(下文 同）形成异戊二烯的活性。
[0056] 如下文所述的核苷酸序列的百分比同一性和氨基酸序列的百分比同一性可利用 Karlin 和 Altschul 的 BLAST 算法（Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873 (1993))和 Pearson 的FASTA算法（Methods Enzymol. ,183,63(1990))来确定。基于该BLAST算法发展了称 作BLASTP和BLASTN的程序（参见http://www. ncbi. nlm. nih. gov)。因此，核苷酸序列和 氨基酸序列的百分比同一性可利用这些程序在缺省设置下来计算。同样，例如，使用来自 Genetyx Corporation 的软件 GENETYX 7. 0· 9 版应用 Lipman-Pearson 方法利用 ORF 中所编 码的全长多核苷酸部分，在"待比较的单元长度=2"的设置下通过计算相似性所获得的作 为百分比的数值可用作氨基酸序列的同源性。来源于这些计算中的值的最低的值可用作核 苷酸序列和氨基酸序列的百分比同一性。
[0057] 在又一个另外的实施方案中，本发明的多核苷酸是在严格条件下与由与以上（i) 或（ii)的核苷酸序列互补的核苷酸序列组成的多核苷酸杂交的多核苷酸，且该多核苷酸 编码具有异戊二烯合酶活性的蛋白质。
[0058] "严格条件"指其中形成所谓的特异性杂交而不形成非特异性杂交的条件。这样的 条件是难以清楚定量的。然而，举例而言，该条件是其中基本上相同的多核苷酸具有高度同 一性的条件，例如，以上所描述的具有百分比同一性的多核苷酸相互杂交，而具有较低同一 性的多核苷酸相互不杂交。特别地，该条件可包括在约45°C下在6 XSCC (氯化钠/柠檬酸 钠）中杂交，然后在50至65°C下在0.2 X SCC和0. 1% SDS中洗涤一次或两次或多次。
[0059] 本发明的饿多核苷酸可以说DNA或RNA，且优选地为DNA。本发明的多核苷酸可源 自黧豆。本发明的多核苷酸还可以是编码本发明下文的蛋白质的一种多核苷酸。
[0060] 〈异戊二烯合酶〉
[0061] 本发明还提供了具有异戊二烯合酶活性的蛋白质。所述异戊二烯合酶活性如以上 所述。
[0062] 在一个实施方案中，本发明的蛋白质是包含以下的蛋白质：（i'）由SEQ ID N0:2 所代表的全长氨基酸序列，或（ii'）由SEQ ID N0:2所代表的氨基酸序列中的第45位至第 594位处的氨基酸残基组成的氨基酸序列。由SEQ N0:2所代表的氨基酸序列中的第1位至 第44位处的氨基酸残基组成的氨基酸序列可编码推测的叶绿体定位信号，且由SEQ N0:2 所代表的氨基酸序列中的第45位至第594位处的氨基酸残基组成的氨基酸序列可编码成 熟的异戊二烯合酶。
[0063] 在另一个实施方案中，本发明的蛋白质是包含与以上α'）或（ii'）的氨基酸序 列具有90%或更高同一性的氨基酸序列的蛋白质，且该蛋白质具有异戊二烯合酶活性。与 氨基酸序列的百分比同一性可以是91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99% 或更1?。
[0064] 在又一个另外的实施方案中，本发明的蛋白质是包含在以上α'）或（?'）的氨基 酸序列中具有一个或数个氨基酸的突变的氨基酸序列的蛋白质，且该蛋白质具有异戊二烯 合酶活性。氨基酸残基的突变的例子可包括氨基酸残基的缺失、置换、添加和插入。可将一 个或数个氨基酸的突变导入到氨基酸序列中的一个区域或多个不同的区域中。术语"一个 或数个"指其中三维结构和蛋白质的活性未较大程度地受损的范围。在蛋白质的情况下， "一个或数个"代表的数目是，例如，1至100,优选地为1至80,更优选地为1至50、1至30、 1至20、1至10或1至5。本发明的蛋白质可以是用于纯化的标签，比如组氨酸标签。
[0065] 当在相同的条件下测量时，本发明的蛋白质优选地具有包含以上α'）或ar)中 任一的氨基酸序列的蛋白质的异戊二烯合酶活性的50%或更高、60%或更高、70%或更高、 80 %或更高、90 %或更高或95 %或更高的异戊二烯合酶活性。关于稳定性，还优选地是，当 在4°C下在某缓冲液[50mM Tris-HCKpH 8.0)，和0· 15mM MgCl2]中储存蛋白质48小时时， 本发明的蛋白质具有的剩余活性为原始活性的30%或更高、40%或更高、50%或更高、60% 或更高或65%或更高。
[0066] 在本发明的蛋白质中，可将突变导入到催化结构域中的位点和除催化结构域之外 的位点中，只要保持了目的活性。能够保持目的活性的待突变的氨基酸残基的位置是本领 域技术人员已知的。特别地，本领域技术人员能够识别结构和功能之间的关联，因为本领域 技术人员能够1)比较具有相同类型的活性的多个蛋白质的氨基酸序列（例如，由SEQ ID NO: 2代表的氨基酸序列与其他异戊二烯合酶的氨基酸序列），2)明确相对保守的区域和非 相对保守的区域，和然后3)从相对保守的区域和非相对保守的区域分别地预测能够起重 要功能作用的区域和不能起重要作用的区域。因此，本领域技术人员能够异戊二烯合酶的 氨基酸序列的待突变的氨基酸残基的位置。
[0067] 当通过置换突变氨基酸残基时，氨基酸残基的置换可以是保守置换。如本文所用 的，术语"保守置换"指利用具有相似的侧链的氨基酸残基置换某些氨基酸残基。具有相似 侧链的氨基酸残基的家族是本领域中已知的。这样的家族的例子可包括具有碱性侧链的氨 基酸（例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸），具有酸性侧链的氨基酸（例如，天冬氨酸、谷氨酸）， 具有不带电荷的极性侧链的氨基酸（例如，天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、 半胱氨酸），具有非极性侧链的氨基酸（例如，甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、 脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸），在具有β位置具有支链的氨基酸（例如，苏氨酸，缬 氨酸、异亮氨酸），具有芳香族侧链的氨基酸（例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸），具 有含羟基（例如，醇式，酚式）侧链的氨基酸（例如，丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸），和具有含硫 侧链的氨基酸（例如，半胱氨酸、甲硫氨酸）。优选地，氨基酸的保守置换可以是天冬氨酸和 谷氨酸之间的置换，精氨酸、赖氨酸和组氨酸之间的置换，色氨酸和苯丙氨酸之间的置换， 苯丙氨酸和缬氨酸之间的置换，亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸之间的置换，和甘氨酸和丙氨酸 之间的置换。
[0068]〈表达载体〉
[0069] 本发明提供了表达载体。本发明的表达载体包含本发明的多核苷酸或编码本发明 的蛋白质的多核苷酸。
[0070] 本发明的表达载体的例子可包括细胞系统载体，其在宿主细胞中表达蛋白质，和 无细胞系统载体，其利用蛋白质翻译系统。表达载体还可以是质粒或整合载体。表达载体 还可以是DNA载体或RNA载体。
[0071] 适宜于宿主细胞的已知载体用作细胞系统载体。表达载体的例子包括基于ColE 质粒，代表为PBR322衍生物，具有pl5A起始点的基于pACYC质粒，基于pSC的质粒和来源 于Bac的F因子的小型F质粒以及大肠杆菌（Escherichia coli)中类似的表达载体。此 夕卜,还可包括具有色氨酸启动子诸如trc和tac的表达载体、Iac启动子、T7启动子、T5启动 子、T3启动子、SP6启动子、阿拉伯糖诱导型启动子、冷休克启动子、四环素诱导型启动子， 和类似物。
[0072] 无细胞系统载体的例子可包括具有在细胞系统载体中示例的T7启动子或T3启动 子的表达载体；和用于在小麦无细胞系统中合成蛋白质的载体，比如基于PEU的质粒，其具 有SP6启动子或T7启动子。
[0073] 在利用无细胞系统载体的蛋白质合成中，首先利用转录系统将目的蛋白质的cDNA 转录而合成mRNA。所述转录系统可包括常规地和公开地已知的那些转录系统，其中通过 RNA聚合酶转录cDNA。RNA聚合酶的例子可包括T7RNA聚合酶。
[0074] 因此，利用无细胞蛋白质合成系统翻译mRNA以合成蛋白质，该系统为翻译系统。 在该系统中，包含翻译所需的核糖体、翻译起始因子、翻译延伸因子、解离因子和氨酰tRNA 合成酶。这样的蛋白质翻译系统的例子可包括大肠杆菌提取物、兔网织红细胞和小麦胚芽 提取物。
[0075] 并且，还可包括重构的无细胞蛋白质合成系统，其由以上翻译所需的因子组成，其 独立地纯化。
[0076] 利用细胞系统载体进行的蛋白质合成将在下文〈转化体〉中描述。
[0077] 可纯化利用细胞系统载体或无细胞系统载体合成的蛋白质。纯化的方法的例子可 包括利用盐析方法和多种层析方法的方法。当设计表达载体以表达标签序列诸如目的蛋白 质的C末端或N末端的组氨酸标签，可应用利用诸如镍或钴的对该标签具有亲和力的物质 利用亲和层析方法的纯化方法。此外，通过适当的纯化方法与离子交换层析、凝胶过滤层析 或类似的方法相组合可提高本发明的蛋白质的纯度。
[0078] 〈转化体〉
[0079] 本发明提供了包含本发明的表达载体的转化体。本发明的转化体是通过将本发明 的表达载体导入到宿主中获得的一种转化体。用于本法麻烦的宿主优选地是细菌或真菌。 细菌可以是革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌。
[0080] 革兰氏阳性菌的例子可包括属于以下的属的细菌：杆菌（Bacillus)、李 斯特菌（Listeria)、葡萄球菌（Staphylococcus)、链球菌（Streptococcus)、肠球 菌（Enterococcus)、梭菌（Clostridium)、棒状杆菌（Corynebacterium)、和链球菌 (Streptomyces)。优选的是属于杆菌属和棒状杆菌属的细菌。
[0081] 属于杆菌属的细菌的例子可包括枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)、炭疽杆菌 (Bacillus anthracis)和錯样芽抱杆菌（Bacillus cereus)。枯草芽抱杆菌是更优选的。
[0082] 属于棒状杆菌的细菌的例子可包括谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum)、有效棒状杆菌（Corynebacterium efficiens)和帚石南棒状杆菌 (Corynebacterium callunae)。谷氨酸棒状杆菌是更优选的。
[0083] 革兰氏阴性细菌的例子可包括属于以下的属的细菌：大肠杆菌（Escherichia)、 泛菌（Pantoea)、沙门氏菌（Salmonella)、弧菌（Vivrio)、沙雷氏菌（Serratia)和肠杆菌 (Enterobacter)。属于大肠杆菌属和肠杆菌属的细菌是优选的。
[0084] 作为属于大肠杆菌属的大肠杆菌是优选的。
[0085] 属于泛菌属的细菌的例子可包括菠萝泛菌（Pantoea ananati s)、斯氏泛菌 (Pantoea stewartii)、成团泛菌（Pantoea agglomerans)和朽1 樣泛菌（Pantoea citrea)。 菠萝泛菌和柠檬泛菌是优选的。欧洲专利申请公开0952221中示例的菌株可用作属于 泛菌属的细菌。属于泛菌属的细菌的代表性菌株的例子可包括公开于欧洲专利申请公 开0952221中的菠萝泛菌AJ13355菌株（FERM BP-6614)和菠萝泛菌AJ13356菌株（FERM BP-6615)。
[0086] 属于肠杆菌属的细菌的例子可包括成团肠杆菌（Enterobacter agglomerans)和 产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes)。产气肠杆菌是优选的。欧洲专利申请公开0952221 中示例的细菌菌株可用作属于肠杆菌属的细菌。属于肠杆菌属的细菌的代表性菌株的例 子可包括成团肠杆菌ATCC12287菌株、产气肠杆菌TACC13048菌株、产气肠杆菌NBRC12010 菌株（Biotechnol. Bioeng.，2007, Mar. 27 ;98 (2) :340-348)和产气肠杆菌 AJl 10637 (FERM BP-10955)。产气肠杆菌AJl 10637菌株自2007年8月22日保藏于国际专利保藏库（IPOD)、 国家先进工业科学和技术研究所（AIST) (Chuo No. 6, Higashi 1-1-1，Tsukuba市，Ibaraki Pref.，JP、邮编305-8566)，并于2008年3月13日基于布达佩斯条约转移到国际保藏中心， 并在此获得编号FERM BP-10955。
[0087] 真菌的例子可包括属于以下的属的微生物：酵母（Saccharomyces)、裂殖酵 母（Schizosaccharomyces)、耶罗威亚酵母（Yarrowia)、木霉（Trichoderma)、曲霉 (Aspergillus)、镰刀霉（Fusarium)和毛霉（Mucor)。属于酵母属、裂殖酵母属、亚罗酵母属 或木霉属的微生物是优选的。
[0088] 属于酵母属的微生物的例子可包括卡尔斯伯酵母（Saccharomyces carlsbergensis)、酉良酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)、分散酵母（Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏酵母（Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母（Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母（Saccharomyces norbensis)和卵形酵母（Saccharomyces oviformis)。酿酒酵母是优选的。
[0089] 粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe)作为属于裂殖酵母属的微生物是优 选的。
[0090] 解脂耶罗威亚酵母（Yarrowia Iypolytica)作为属于耶罗威亚酵母属的微生物是 优选的。
[0091] 属于木霉属的微生物的例子可包括哈茨木霉（Trichoderma harzianum)、康氏 木霉（Trichoderma koningii)、长枝木霉（Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉 (Trichoderma reesei)和绿色木霉（Trichoderma viride)。里氏木霉是优选的。
[0092] 此外，用于本发明的宿主不受具体局限，只要宿主具有经由参与二甲基丙烯基二 磷酸盐的合成的甲羟戊酸（MVA)途径和/或甲基赤藓醇磷酸盐（MEP)途径合成作为异戊二 烯合酶的底物的二甲基丙烯基二磷酸盐（DMPP)的能力，且宿主可以是昆虫细胞、动物细 胞、植物细胞和类似物。
[0093] 在本发明的转化体中，可增强合成作为异戊二烯合酶的底物的二甲基丙烯基二磷 酸盐（DMPP)的途径。对于该增强，可将表达具有将异戊烯二磷酸（IPP)转化为二甲基丙 烯基二磷酸盐（DMPP)的能力的异戊烯-二磷酸δ异构酶的表达载体导入到本发明的转 化体中。还可将参与与IPP和/或DMPP的形成相关的甲羟戊酸途径和/或甲基赤藓醇磷 酸盐途径的一种或多种酶导入到本发明的转化体中。用于这样的酶的表达载体可以是质粒 或整合型载体。用于这样的酶的表达载体还可以是DNA载体或RNA载体。用于这样的酶的 表达载体还可表达参与甲羟戊酸途径和/或甲基赤藓醇磷酸盐途径中的多种酶（例如，一 种、两种、三种或四种或更多种），且可以是，例如，用于多顺反子性mRNA的表达载体。参与 甲羟戊酸途径和/或甲基赤藓醇磷酸盐途径中的一种或多种酶的来源可以是与宿主同源 的或异源的。当参与甲羟戊酸途径和/或甲基赤藓醇磷酸盐途径中的酶的来源与宿主同源 时，例如，宿主可以是如以上所描述的细菌（例如，大肠杆菌）和参与甲羟戊酸途径的酶可 以来源于真菌（例如，酿酒酵母）。此外，当宿主固有地产生参与甲基赤藓醇磷酸盐途径时， 待导入到宿主中的表达载体可表达参与甲羟戊酸途径的酶。
[0094] 异戊烯-二磷酸δ异构酶（EC:5. 3. 3. 2)的例子可包括Idilp (编号ΝΡ_015208)、 AT3G02780 (编号 NP_186927)、AT5G16440 (编号 ΝΡ_197148)和 Idi (编号 ΝΡ_417365)。
[0095] 参与甲羟戊酸（MVA)途径的酶的例子可包括甲羟戊酸激酶（EC:2. 7. 1. 36 ;例 l，Ergl2p，编号 NP_013935 ;例 2，AT5G27450,编号 NP_001190411)，磷酸甲羟戊酸激酶 (EC:2. 7. 4. 2 ;例 l，Erg8p，编号 NP_013947 ;例 2，AT1G31910,编号 NP_001185124,二磷 酸甲羟戊酸脱羧酶（EC:4. 1. 1.33;例 l，Mvdlp，编号 NP_014441 ;例 2，AT2G38700,编号 NP_181404 ;例 3, AT3G54250,编号 NP_566995)，乙酰辅酶 A 酰基转移酶（EC:2. 3. 1. 9 ;例 1，ErglOp，编号 NP_015297 ;例 2, AT5G47720,编号 NP_001032028 ;例 3, AT5G48230,编号 NP_568694)，羟甲基戊二酰辅酶 A 合酶（EC:2. 3. 3. 10 ;例 1，Ergl3p，编号 NP_013580 ;例 2, AT4G11820,编号NP_192919 ;例3, MvaS，编号AAG02438)，羟甲基戊二酸辅酶A还原酶 (EC:1. I. 1. 34 ;例 l，Hmg2p，编号 NP_013555 ;例 2，Hmglp，编号 NP_013636 ;例 3，AT1G76490， 编号 NP_177775 ;例 4, AT2G17370,编号 NP_179329, EC: I. I. L 88,例，MvaA，编号 P13702)， 和乙酰CoA酰基转移酶/羟甲基戊二酸辅酶A还原酶（EC:2. 3. 1.9/1. 1. 1.34,例，MvaE，编 号 AAG02439)。
[0096] 参与甲基赤藓醇磷酸盐（MEP)途径的酶的例子可包括1-脱氧-D-木酮糖5-磷 酸合酶（EC:2. 2. 1. 7,例 l，Dxs，编号 NP_414954 ;例 2，AT3G21500,编号 NP_566686 ;例 3, AT4G15560,编号 NP_193291 ;例 4, AT5G11380,编号 NP_001078570)，1-脱氧-D-木酮 糖 5-磷酸还原异构酶（EC:1. I. 1. 267 ;例 l，Dxr，编号 NP_414715 ;例 2, AT5G62790,编 号 NP_001190600)，4_ 二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓醇合酶（EC:2. 7. 7. 60 ;例 1，IspD， 编号 NP_417227 ;例 2，AT2G02500,编号 NP_565286)，4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓 醇激酶（EC:2. 7. L 148 ;例 1，IspE，编号 NP_415726 ;例 2，AT2G26930,编号 NP_180261)， 2-〇甲基-0-赤藓醇-2,4-环二磷酸合酶伍(：:4.6.1.12;例1，18口卩，编号即_417226 ; 例 2, AT1G63970,编号 NP_564819)，1-羟基-2-甲基-2-(E) - 丁烯基-4-二磷酸合酶 (EC:1. 17.7. 1 ;例 1，IspG,编号 NP_417010 ;例 2，AT5G60600,编号 NP_001119467)和 4-羟 基-3-甲基-2-丁烯基磷酸还原酶（EC:1. 17. 1.2 ;例1，IspH，编号NP_414570 ;例2， AT4G34350,编号 NP_567965)。
[0097] 将包含基因的表达载体导入到宿主（转化）中可利用已知方法来进行。这样的方 法的例子包括使用利用钙处理的微生物细胞的感受态细胞方法和电穿孔方法。可通过利用 噬菌体载体而非质粒载体感染微生物细胞来导入基因。
[0098] 并且，还可将编码参与甲羟戊酸途径或甲基赤藓醇磷酸盐途径的酶的基因导入到 本发明的转化体中，所述酶合成作为异戊二烯合酶的底物的二甲基丙烯基二磷酸盐。
[0099] 这样的酶可包括1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶，其将丙酮酸和D-甘油醛-3-磷 酸转化为1-脱氧-D-木糖5-磷酸，和异戊基二磷酸异构酶，其将异戊基二磷酸转化为二甲 基丙稀基-憐酸盐。
[0100] 可从本发明的转化体中提取或纯化本发明的蛋白质，且异戊二烯可通过培养表达 本发明的蛋白质的转化体来产生。
[0101]〈产异戊二烯单体和异戊二烯聚合物的方法〉
[0102] 本发明提供了产生异戊二烯单体的方法。产生本发明的异戊二烯单体的方法包括 在本发明的蛋白质的存在下从二甲基丙烯基二磷酸盐形成异戊二烯单体。
[0103] 产生本发明的异戊二烯单体的方法不是特别局限的，只要在本发明的蛋白质的存 在下进行方法，且可通过使用利用本发明的蛋白质自身（例如，纯化的蛋白质）的酶反应系 统来进行方法或培养产生本发明的蛋白质的本发明的转化体。优选地，其通过培养本发明 的转化体来进行。当本发明的转化体用于本发明的产生异戊二烯单体的方法中时，通过本 发明的转化体在培养基中的碳源中有效地供给作为异戊二烯单体的原料的二甲基丙烯基 二磷酸盐。在培养基中，本发明的转化体产生主要作为来自碳源的排气的异戊二烯单体。因 此，通过收集从转化体产生的气体来回收异戊二烯单体。在培养基中经由宿主中的甲羟戊 酸途径或甲基赤藓醇磷酸盐途径从碳源合成异戊二烯合酶的底物二甲基丙烯基二磷酸盐。
[0104] 用于培养本发明的转化体的培养基优选地包含待转化为异戊二烯的碳源。碳源可 包括碳水化合物诸如单糖、二糖、寡糖和多糖；由水解蔗糖获得的转化糖；甘油；具有一个 碳原子的化合物（下文称作Cl化合物）诸如甲醇、甲醛、甲酸、一氧化碳和二氧化碳；油诸 如玉米油、棕榈油和大豆油；乙酸盐；动物脂肪；动物油；脂肪酸诸如饱和脂肪酸和不饱和 脂肪酸；脂质；磷脂；甘油酯；甘油脂肪酸酯诸如甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯；多肽诸如 微生物蛋白质和植物蛋白质；可再生碳源诸如水解的生物质碳源；酵母提取物，或其组合。 关于氮源，可使用无机铵盐诸如硫酸铵、氯化铵和磷酸铵，有机氮诸如水解的大豆、氨气、氨 水和类似的氮源。理想的是包含合适的量的需要的物质诸如维生素 Bl和L-高丝氨酸或酵 母提取物和类似物，作为有机痕量营养物来源。此外，若需要的话，添加少量的磷酸钾、硫酸 镁、铁离子、镁离子和类似物。用于本发明的培养基可以是天然培养基或合成的培养基，只 要其包含碳源、氮源、无机离子和任选地其他有机痕量成分。
[0105] 单糖的例子可包括丙糖诸如酮丙糖（二羟基丙酮）和丙醛糖（甘油）；四糖诸如酮 丁糖（赤藓酮糖）和丁醛糖（赤藓糖，苏糖）；戊糖诸如戊酮糖（核酮糖、木酮糖），戊醛糖 (核糖、阿拉伯糖、木糖、来苏糖）和脱氧糖（脱氧核糖）；己糖诸如已酮糖（诸如psychose、 果糖、山梨糖、塔格糖），己醛糖（阿洛糖、阿卓糖、葡萄糖、甘露糖、古洛糖、艾杜糖、半乳糖、 妥尔糖（tallose)，和脱氧糖（岩藻糖、蔗糖、鼠李糖）；和庚糖诸如景天庚酮糖。C6糖诸如 果糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖；和C5糖诸如木糖和阿拉伯糖是优选的。
[0106] 二糖的例子可包括蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、松二糖和纤维二糖。蔗糖和乳糖是 优选的。
[0107] 寡糖的例子可包括三糖诸如棉子糖、松三糖和麦芽三糖；四糖诸如阿卡波糖和水 苏糖；和其他寡糖诸如低聚果糖（FOS)、低聚半乳糖（GOS)和低聚甘露糖（MOS)。
[0108] 多糖的例子可包括糖原、淀粉（淀粉糖、支链淀粉）、纤维素、糊精和葡聚糖（β 1， 3-葡聚糖），和淀粉和纤维素是优选的。
[0109] 微生物蛋白质的例子可包括来源于酵母或细菌的多肽。
[0110] 植物蛋白质的例子可包括来源于大豆、玉米、油菜、麻风树、棕榈、椰子、向日葵、花 生、芥末、棉花种子、棕榈仁油、橄榄、红花、芝麻和亚麻子的多肽。
[0111] 脂质的例子可包括包含C4或更多碳的一种或多种饱和或不饱和脂肪酸。
[0112] 油优选地为包含C4或更多C的一种或多种饱和或不饱和脂肪酸的脂质，且在室温 下为液体，和油的例子可包括来源于大豆、玉米、油菜、麻风树、棕榈、椰子、向日葵、花生、芥 末、棉籽、棕榈仁油、橄榄、红花、芝麻、亚麻子、油质微生物细胞、乌柏树，和其两种或更多种 的组合的脂质。
[0113] 脂肪酸的例子可包括由式RCOOH代表的化合物（"R"代表烃基）。
[0114] 不饱和脂肪酸是在"R"中的两个碳原子之间具有至少一个双键的化合物，且不饱 和脂肪酸的例子可包括油酸、异油酸、亚油酸、棕榈烯酸和花生四烯酸。
[0115] 饱和脂肪酸是其中"R"是饱和脂族基的化合物，和饱和脂肪酸的例子可包括 二十二烷酸、花生酸、十八烷酸、十六烷酸、十四烷酸和十二烷酸。
[0116] 其中，包含一个或多个C2至C22脂肪酸的那些是优选的脂肪酸，和包含C12脂肪 酸、C14脂肪酸、C16脂肪酸、C18脂肪酸、C20脂肪酸和C22脂肪酸的那些是更优选的。
[0117] 碳源可包括盐和这些脂肪酸的衍生物及这些衍生物的盐。盐的例子可包括锂盐、 钾盐和钠盐。
[0118] 碳源的例子还可包括碳水化合物的组合，诸如糖与脂质、油、脂肪，脂肪酸和甘油 脂肪酸酯的组合。
[0119] 可再生碳源可能包括解生物质碳的来源。
[0120] 生物质碳源的例子可包括基于纤维素的底物，诸如木材的废料、纸和纸浆、多叶植 物和果浆；和部分植物诸如茎、谷物颗粒、根和块茎。
[0121] 用作生物质碳源的植物的例子可包括玉米、小麦、黑麦、高粱、小黑麦、大米、小米、 大麦、树薯，豆类诸如豌豆、马铃薯、甘薯、香蕉、甘蔗和木薯。
[0122] 当将可再生碳源诸如生物质添加到培养基时，优选地碳源是预处理的。预处理的 例子可包括酶预处理、化学预处理和酶处理与化学预处理的组合。
[0123] 优选的是可再生碳源在添加到培养基之前是完全或部分水解的。
[0124] 碳源的例子还可包括酵母提取物和酵母提取物与另外的碳源诸如葡萄糖的组合。 酵母提取物与Cl化合物诸如一氧化碳和甲醇的组合是优选的。
[0125] 在培养与本发明有关的转化体的方法中，优选的是在含有盐溶液和营养物的标准 培养基中培养细胞。
[0126] 培养基并不特别局限，且培养基的例子可包括现成的可从商业上获得的一般培养 基，诸如Luria Bertani(LB)肉汤、沙氏葡糖琼脂（SD)肉汤和酵母培养基（YM)肉汤。可选 自适于使用的培养特定宿主的培养基。
[0127] 理想的是，除细胞培养基中适当的碳源之外，包含合适的矿物、盐、补充元素、缓冲 液和本领域技术人员已知适于培养和利于异戊二烯产生的成分。
[0128] 优选的将糖、金属盐、抗菌物质和类似物添加到培养基以维持本发明的转化体中 表达本发明的蛋白质。
[0129] 用于本发明的转化体的培养条件并不特别局限，只要能够表达本发明的蛋白质， 且能够使用标准的细胞培养条件。
[0130] 培养温度优选地为20°C至37°C，气体组成优选地为6-84%的CO2浓度，和pH值优 选地为约5至约9。
[0131] 根据宿主的性质不同，优选地在有氧的、无氧的或厌氧的条件下培养转化体。
[0132] 培养转化体的方法的例子可包括使用已知的发酵方法，诸如批量培养方法、补料 培养方法或连续培养方法。
[0133] 在批量培养方法中，在发酵起始添加培养基组合物，并将转化体接种到培养基组 合物中，在PH和氧浓度受控下进行培养。
[0134] 在通过批量培养方法培养转化体时，转化体的生长始于温和诱导期，经过对数生 长期并最终经历生长速度下降或停止的静止期。异戊二烯通过对数生长期和静止期的转化 体来产生。
[0135] 在补料培养方法中，除了以上批量方法之外，根据发酵进程逐渐地添加碳源。当培 养基中的碳源的量将受限时，补料培养方法是有效的，因为转化体的新陈代谢由于分解代 谢产物抑制倾向于降低。补料培养可利用限定的量或过量的量的碳源诸如葡萄糖来进行。
[0136] 在连续培养方法中，以恒定的速率将某些量的培养基连续地供给到生物反应器， 同时去除相同的量的培养基。在连续培养方法中，可以高浓度恒定地保持培养，且培养基中 的转化体通常在对数生长期。
[0137] 可通过适当地完全或部分替换培养基来补充培养，且可防止对转化体的生长可能 具有副作用的代谢副产物的积累，及死亡细胞的积累。
[0138] 本发明的表达载体具有的启动子可包括组成型启动子和可诱导型启动子。当本发 明的表达载体具有可诱导型启动子诸如Iac启动子时，可通过将IPTG(异丙基硫代半乳糖 苷）添加到培养基中来诱导本发明的蛋白质的表达。
[0139] 评估通过培养本发明的转化体产生的异戊二烯的量的方法的例子可包括方法：其 中通过顶空法收集气相并通过气相色谱来分析该气相。
[0140] 具体地，顶空中的异戊二烯单体通过在密封小瓶中伴随振荡培养基培养转化体来 获得，通过标准气相色谱分析该异戊二烯单体。然后，利用标准曲线，将通过气相色谱测量 的曲线所计算的面积转化为利用转化体产生的异戊二烯单体的量。
[0141] 收集通过培养本发明的转化体获得的异戊二烯单体的方法的例子可包括气提法、 分馏法或通过热或真空吸附于固相的异戊二烯单体的解离，或利用溶剂提取。
[0142] 在气提方法中，将异戊二烯气体持续地从排气中移除。该异戊二烯的移除可通过 多种方法来进行。移除的例子可包括吸附于固相，分离于液相中，和其中将异戊二烯气体直 接浓缩的方法。
[0143] 异戊二烯单体可通过单一步骤或多步骤来收集。当通过单一步骤收集异戊二烯单 体时，将异戊二烯单体转化为液相，同时伴随从排气中分离异戊二烯单体。还可将异戊二烯 单体从排气中直接浓缩以生成液相。当通过多阶段收集异戊二烯单体时，从排气中分离异 戊二烯单体，且然后将其转化为液相。例如，使异戊二烯单体吸附于固相，并利用溶剂从固 相中提取异戊二烯单体。
[0144] 收集异戊二烯单体的方法还包括纯化异戊二烯单体。纯化的方法可包括通过蒸馏 和多种色谱法从液相提取物中分离。
[0145] 本发明的蛋白质在产生异戊二烯的能力上比常规异戊二烯合酶更为优越。因此， 利用表达本发明的蛋白质的转化体可有效地产生异戊二烯单体。
[0146] 本发明还提供了产生异戊二烯聚合物的方法。根据本发明的产生异戊二烯聚合物 的方法包括以下的（I)和（II):
[0147] (I)通过本发明的方法形成异戊二烯单体；和
[0148] (II)使异戊二烯单体多聚和以形成异戊二烯聚合物。
[0149] 可与以上所描述的产生本发明的异戊二烯单体的方法相同的方式进行步骤（I)。 步骤（II)中的异戊二烯单体的聚合可通过本领域中已知的任何方法来进行。 实施例
[0150] 以下将参照实施例具体描述本发明，但本发明不限于以下实施例。
[0151] 实施例1 :在植物中评估产生异戊二烯的能力
[0152] 1-1)测量每单位重量干叶形成的异戊二烯的量
[0153] 首先，测量植物中每Ig干叶形成的异戊二烯的量以评估在植物中产生异戊二烯 的能力。使用黧豆（黄毛黧豆（Mucuna bracteata))、垂柳（Salix babylonica)、美洲枫 香（Liquidambar styraciflua)、桃金娘（香桃木（Myrtus communis))和野葛（Pueraria Iobata)作为植物。
[0154] 在形成的异戊二烯的量的测量中，将气体可替换干燥器（商品名：Vacuum Desiccator，由 AS ONE Corporation 生产）置于孵育器（商品名：Growth Chamber MLR-351H，由SANYO生产），并将孵育器设置为高温诱导条件（40°C下100 μ mol E/m2/s照 明），同时驱动设置于气体可替换干燥器中的用于搅动空气的风扇搅动气体可替换干燥器 中的空间里的空气。在气体可替换干燥器中的空气温度达到40°C之后，将种植于种植器 中的黧豆的植物体置于其中并在空气可替换干燥器密封的状态下持续3小时。然后，通过 抽吸泵经由硅管、吸附管和气体收集管从气体可替换干燥器中的空间中吸出从黧豆释放 的气体组分。从而，从黧豆中释放的气体组分中的水蒸气（水含量）在吸附管中吸附和 分离，将已分离水蒸气的气体组分导入到气体收集管。随后，利用气相色谱仪（商品名： GC-FID6890,由Agilent生产）定量分析气体收集管中收集的气体组分中所含的异戊二烯。
[0155] 关于干叶的重量，新鲜的单叶的叶面积和当新鲜的单叶在干燥器中在80°C下干燥 8小时的干重建立了极好的正相关。因此，推导了从叶面积转化为干重的公式，并从来自用 于测量形成的异戊二烯的量的黧豆的植物体的整个叶面积评估干重。
[0156] 通过将从黧豆的整个植物体形成的异戊二烯的量除以所估计的整个植物体的重 量得到每Ig干叶形成的异戊二烯的量。
[0157] 结果证明了在每单位重量干叶形成的异戊二烯的量方面，黧豆是优越的（图1)。
[0158] 1-2)测量由总蛋白质量形成的异戊二烯的量
[0159] 然后，测量从不同的植物的叶提取的总蛋白质的量形成的异戊二烯的量。使用黧 豆（样品1和2)、垂柳、美洲枫香、桃金娘和野葛作为植物。
[0160] 关于提取蛋白质，制备了缓冲液溶液（50mM Tris-HCl，20mM MgCl，5%甘油， 0.02%Triton-X100，pH 8.0)，在立即使用前添加 10%Polyclar AT，20mM DTT，完全蛋白 质酶片（一片/50mL)，和ImM苯甲脒HC1(终浓度，每种），并用作蛋白质提取缓冲液。将 50mL的蛋白质提取缓冲液添加至5g的样品，然后在冰上的冰冷的研钵中彻底地研磨混合 物并通过双重重叠的Miracloth过滤。将滤出液在12, 000G下离心20分钟，并在40, 000G 下离心40分钟以获得上清液，将上清液用作粗提取物。
[0161] 随后，利用硫酸铵分级分离该粗提取物。将硫酸铵的终浓度的40% -55%的范围 中沉淀的蛋白质在40, 000G下离心40分钟，并将获得的沉淀物在蛋白质提取缓冲液中重新 溶解以获得硫酸铵级分。
[0162] 利用Bradford测定通过测量硫酸铵级分计算总（硫酸铵级分）蛋白质的质量。 将Bradford试剂与标准蛋白，牛血清白蛋白反应，利用分光光度计测量595nm波长处的吸 光度。利用获得的吸光度数值生成蛋白的标准曲线。还在稀释50倍的硫酸铵级分中测量 了 595nm波长处的吸光度，并从标准蛋白的标准曲线评估了总（硫酸铵级分）蛋白的量。
[0163] 在形成的异戊二烯的量的测量中，将在100°C下煮沸的IOOyL的粗提取物或 100 μ L的粗酶溶液置于4mL玻璃小瓶中，且然后将2 μ L的0. 5M MgCl2溶液和5 μ L的 0.2Μ DMPP溶液添至其中。利用带隔板的螺旋帽紧密封闭小瓶，且然后轻轻震动小瓶并置 于40°C下的孵育器中。0. 5、1和2小时后，通过气密注射器取样顶隙中的0. 5至2mL的气 体层，并利用气相色谱仪（商品名：GC-FID6890,由Agilent制造）测量形成的异戊二烯的 量。通过从利用粗酶的情况下测量的值中减去利用在l〇〇°C煮沸的粗酶溶液的情况下测量 的值，计算〇. 5小时、1小时和2小时之后利用粗酶形成的异戊二烯的量。从每小时形成的 异戊二烯的量计算每Img总蛋白质的酶活性（比活性）。保持作为异戊二烯合酶的底物的 DMPP的量恒定下，测量形成的异戊二烯的量。
[0164] 结果，证明了在由总蛋白质的量形成的异戊二烯的量方面，黧豆是优异的（图2， 表1)。如上所述，显示了黧豆具有优异的产生异戊二烯的能力。
[0165] 表1.由总蛋白质的量形成的异戊二烯的量（相对于野葛的情况的指数数字）
[0166]

【权利要求】
1. 一种多核巧酸，为W下的（a)、（b)或（c)所示的多核巧酸： (a)-种多核巧酸，包含（i)由SEQ ID N0:1代表的核巧酸序列，或（ii)由SEQ ID N0:1 代表的核巧酸序列中的第133位至第1785位的核巧酸残基组成的核巧酸序列； 化）一种多核巧酸，其包含与（i)或（ii)的所述核巧酸序列具有90%或更高同一性的 核巧酸序列，并编码具有异戊二帰合酶活性的蛋白质；或 (C) 一种多核巧酸，其在严格条件下与由与（i)或（ii)的核巧酸序列互补的核巧酸序 列组成的多核巧酸杂交，并编码具有异戊二帰合酶活性的蛋白质。
2. 根据权利要求1所述的多核巧酸，其中所述多核巧酸来源于驚豆（Mucuna)。
3. -种蛋白质，为W下的（A)、做或似所示的蛋白质： (A) -种蛋白质，包含a')由SEQ ID NO:2代表的全长氨基酸序列，或（ii')由SEQ ID NO:2代表的氨基酸序列中的第45位至第594位的氨基酸残基组成的氨基酸序列； 炬）一种蛋白质，其包含与a')或（ii')所述的氨基酸序列具有90%或更高同一性 的氨基酸序列，并具有异戊二帰合酶活性；或 (C) 一种蛋白质，其包含在a')或（ii')所述的氨基酸序列中具有一个或几个氨基酸 的缺失、置换、添加或插入的氨基酸序列，并具有异戊二帰合酶活性。
4. 一种表达载体，包含根据权利要求1或2所述的多核巧酸或编码根据权利要求3所 述的蛋白质的多核巧酸。
5. -种转化体，所述转化体通过将根据权利要求4所述的表达载体导入宿主中而制 备。
6. 根据权利要求5所述的转化体，其中所述宿主具有经由甲基赤薛醇磯酸盐途径合成 二甲基丙帰基二磯酸盐的能力。
7. 根据权利要求6所述的转化体，其中所述宿主是大肠杆菌。
8. 根据权利要求5-7中任一项所述的转化体，其中所述转化体具有经由两个途径，即 甲轻戊酸途径和甲基赤薛醇磯酸盐途径合成二甲基丙帰基二磯酸盐的能力。
9. 根据权利要求5所述的转化体，其中所述宿主是属于棒状杆菌属 (Corynebacterium)、泛菌属（Pantoea)、肠杆菌属巧nterobacter)或酵母菌属 (Saccharomyces)的微生物。
10. -种产生蛋白质的方法，所述方法包括利用根据权利要求5-9中任一项所述的转 化体形成根据权利要求3所述的蛋白质。
11. 一种产生异戊二帰单体的方法，所述方法包括在根据权利要求3所述的蛋白质的 存在下从二甲基丙帰基二磯酸盐形成所述异戊二帰单体。
12. 根据权利要求11所述的方法，其中所述异戊二帰单体通过培养根据权利要求5-9 中任一项所述的转化体来形成。
13. 根据权利要求12所述的方法，其中所述二甲基丙帰基二磯酸盐通过培养所述转化 体而由培养基中的碳源来供给。
14. 一种产生异戊二帰聚合物的方法，包括（I)和（II): (I) 通过根据权利要求11-13中任一项所述的方法形成异戊二帰单体；和 (II) 使所述异戊二帰单体聚合W形成所述异戊二帰聚合物。
【文档编号】C12N9/88GK104471061SQ201380028453
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2013年3月12日 优先权日:2012年5月30日
【发明者】林泰行, 原田美奈子, 高冈纱彩, 福岛靖王, 横山敬一, 西尾阳介, 田岛义教, 三原洋子, 中田国夫 申请人:株式会社普利司通, 味之素株式会社