专利名称：一种用于mtDNA等位基因分型及点突变检测的ARMS-PCR方法
技术领域：
本发明属于分子遗传学领域，尤其涉及线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)多 态性基因型鉴定及点突变检测方法。
背景技术：
为了解mtDNA突变或多态性与疾病关联而进行的病例对照研究中，往往涉及对大 量个体的多态性基因型进行区别鉴定；mtDNA相关疾病的分子诊断、遗传咨询和用药指导 等服务，也都需要快速、简便、有效的突变分析或基因分型方法。 限制性酶类方法如限制性片段长度多态性(restriction fragment 1 engthpo 1 ymorphi sms ， RFLPs)分析是当前进行mtDNA点突变或mtDNA单个位点核苷酸多态 性(mitochondrial DNA single nucleotide polymorphisms，mtSNPs)检测的主要方法，如 mt4833A/G置换多态可通过Hae 11、mt5178C/A经Alu 1、mtl0398A/G经Bgl I及mtl5497G/ A经Dde I等不同限制性酶识别序列获得鉴定；但该方法仅适用于待检多态性或突变位点 附近存在适当的特定限制性内切酶酶切识别序列的情况。 此夕卜，由于mtDNA分子较小(16，569bp)，随着DNA测序技术不断进步同时成本不断 下降，mtDNA全长或部分(如编码区)序列分析也成为mtDNA多态性和基因突变分析的常 用方法，但这不仅需要特定的测序试剂盒和自动测序仪及检测设备等，还需要从长的测序 结果中比对确定靶位点核苷酸，因此对于mtDNA单个位点特定多态性的明确而言，这是一 个消耗大量成本和工作量而仅获得非直接结果的不经济的方法。 扩增难熔突变系统(amplification refractory mutation system,ARMS)或称等 位(基因)特异性扩增(allele-specific amplification,ASA)是验证性检测DNA序列变 化的经典方法之一。ARMS-PCR基因分型检测通常包括两个互补的PCR反应，使用相同的DNA 模板和一条相同的共有引物及其他条件，区别仅在于与共有引物配对的ARMS引物不同，一 条3'末端与给定位点上的一种特定核苷酸互补，与另一种则为错配，反之另一条引物亦如 此。因而两个反应只能选择性扩增特定的DNA模板，即只有ARMS引物完全退火结合的反应 可顺利进行，而3'末端不匹配引物的延伸受到阻滞。虽然在原理上ARMS-PCR只要针对核 苷酸可变(基因突变或多态性)位点进行特异性错配引物设计即可，但由于mtDNA分子大 小及结构复杂度远较核基因组DNA小，且在细胞内呈多拷贝，导致其模板效用性远较核DNA 高，致使常规使用的仅3'末端碱基(核苷酸)错配的ARMS引物不足以形成对相同模板的 扩增效率差异，因此，现有技术领域中没有将ARMS-PCR用于mtDNA突变或mtSNPs检测的方 法。
发明内容
本发明的目的在于解决现有mtDNA基因型多态性分析方法的不足，针对mtDNA模 板效用性较核基因组DNA高而不易形成错配引物间PCR扩增效率差异的特点，提出一种优化改进的ARMS-PCR方法用于mtDNA点突变检测或mtSNPs多态性基因型鉴定。
本发明检测mtDNA点突变或mtSNPs多态性基因型的ARMS-PCR方法的详细技术方 案为针对mtDNA突变或多态性待测位点，设计特异性ARMS适配引物，使引物3'末端终止 在待诊位点，同时在ARMS引物(位于上游或下游均可)3'端倒数3-4位增加设置两个连续 的碱基错配，错配方式为A-T或G-C的互换；但ARMS-PCR扩增反应中增加模板mtDNA的用量 为常规PCR扩增mtDNA的2 10倍，如20 lOOng总基因组DNA (其中包含mtDNA) /25uLPCR 反应体系；PCR扩增获得包含靶位点的一段mtDNA片段，最后通过琼脂糖凝胶电泳加以检 测，根据阳性反应确定待检基因型。 对于mtDNA而言，其中存在大量密集排布的多态性位点，所选择设计的错配ARMS 引物中不应再包含其他潜在的不匹配核苷酸，因此本发明中，通过选择错配引物的位置在 上游或者在下游，可以尽量避开其他潜在的多态性位点，从而避免可能的假阴性PCR扩增 结果，这使得该方法的模板适用范围得以扩大。 本发明依据传统ARMS-PCR技术的原理，进行了增加ARMS引物3'端错配碱基数和 PCR反应模板DNA用量的双重改进，前者降低PCR扩增效率，后者则提高。非适配ARMS引物 中因联合了对扩增效率影响更大的3'末端错配，使得模板mtDNA的扩增效率严重下降，即 使模板mtDNA用量增加也不足以纠正，而3'末端适配的ARMS引物扩增效率本就显著高于 非适配引物，模板DNA用量增加则进一步纠正了添加的错配对扩增效率的影B向，因而能获 得足够检测灵敏度的产物累积。这种双重因素的平衡调节，纠正了因mtDNA模板效用高而 造成的PCR扩增效率差异不明显的缺陷，从而使得ARMS-PCR可用于mtDNA的单个位点基因 分型检测。 与现有mtDNA点突变或mtSNPs多态性基因型检测方法相比，ARMS-PCR技术用于 mtDNA多态性或基因变异检测不仅结果高度可靠，而且在操作和实用性上还具有独特优势 PCR扩增结合琼脂糖凝胶电泳检测的操作能简单地在装备程度较低的实验室中实施；不依 赖特异性限制性内切酶识别位点而进行限制性消化，也不需要诸如样品的过夜消化、沉淀、 脱盐或大量洗涤等费时操作；不需要同位素或其他标记物进行标记；能用简单的紫外检 测，不需要昂贵的激光诱导性荧光检测设备等等，都极大地加速了分析过程，同时减少了不 必要的费用和工作量。尤其对mtSNPs多态性检测而言，由于mtSNP具有源于母系单系遗传 的特殊性，导致个体仅以纯合子基因型相区分，不需要考虑见于核基因多态性的杂合子基 因型情况，即仅以扩增产物的有无就可判断分型结果，因此采用ARMS-PCR方法进行基因分 型更为简便易行，结果也完全可以信赖。
图1实施例1中设计的6对ARMS-PCR扩增引物； 图2实施例1中以3G禾P 4A引物方案进行ARMS-PCR扩增确定mtSNP8701A/G基因 分型的电泳图。
具体实施例方式
实施例1用本发明的方法检测mtSNP 8701A/G 以mtSNP 8701A/G的个体基因分型为例，针对其在不同个体中A和G两种核苷酸的交替变化，进行了符合ARMS-PCR扩增原理的错配引物设计，并使用优化的扩增条件对 200例DNA样品进行基因分型检测，其结果与序列分析分型的结果相互吻合。
(1).设计ARMS-PCR扩增引物 实验设计了 6对ARMS-PCR扩增引物，如图1所示。共用上游引物为ATFl (np8466 8587) 。 6条位于下游的ARMS引物3'末端固定地终止于mtDNAnp8701位点，并针对两种SNP 等位基因之间G和A的核苷酸置换，设计了在3'端相互区别的6条下游引物。
如图l所示，WG引物的3'末端碱基与G型等位基因序列完全互补匹配，与A型 基因则为错配；反之，^2A引物与A型基因完全互补，但其3'末端与G型基因错配。同理， 成对设计的3G和4A、5G和6A引物的3'末端也分别仅与两种等位基因之一匹配，与另一种 为错配。此外，3G和4A引物3'端倒数第3-4位加入错配，GT — CA ;5G和6A的3'端倒数 第2-3位错配，GG — CC。因此，6条下游引物中，有2条分别与G或A等位基因完全匹配， 其余4条均部分错配。 图1中下划线部分示意除3'末端外附加的错配位置及碱基。这6条在相同核苷 酸位置上的下游ARMS引物与共同上游引物配对组成了三套引物，每套引物包括2条下游引 物(即1G+2A、3G+4A和5G+6A)及上游引物ATF1，被用来建立检测mtDNA G8701A SNP个体 基因型的ARMS-PCR方案，即在优化的PCR扩增条件下，选择三套引物中适用于基因分型检 测者，目标是使得模板DNA的两个平行PCR扩增之一显示阳性结果，另一个显示阴性结果， 组合的电泳图谱结果具有个体特异性，因而个体可获检mtDNA G8701A SNP基因型。通过实 验结果表明3G和4A是该方案中适合的ARMS引物(参见附图2)，也就是说，ARMS-PCR用 于mtDNA单核苷酸多态性基因型检测时，ARMS弓I物设计时应当在3'末端倒数3 4位增 加设置两个连续的碱基错配，错配方式为A-T或G-C的互换。
(2). ARMS-PCR扩增反应 以PCR扩增在25ii L总体积中进行为例，以基因组总DNA约50ng为模板；其他PCR 反应成份及其浓度为常规使用，如每种dNTP浓度为200 ii M，上、下游引物各5-10pmo1， 50mM KCl，10mM Tris-HCl(pH8. 3'25。C )，1. 5mM MgCl2及0. 5U rTaq DNA聚合酶(TaKaRa公司， 大连)；PCR扩增参数亦为常规使用，如94°C 30s，56。C 30s和72°C 30s，循环30个周期后于 72t:充分延伸5min。 实验中ARMS-PCR扩增的参数主要针对引物退火温度和扩增循环数进行调整，结 果表明常规PCR的30次左右循环、57t:左右退火温度(根据不同PCR扩增仪的性能差异调 整)为优化条件。 (3).琼脂糖凝胶电泳鉴别样品mtSNP 8701A/G基因型 按常规操作进行，如取每份PCR扩增产物5 ii L与适量上样缓冲液混合后分别加 至1. 5%琼脂糖凝胶(含0. 5mg/L EB)，使用0. 5XTBE电泳缓冲液(45mmol/L Tris-硼酸， lmmol/L EDTA，pH 8. 0)，于12V/cm电压下恒压电泳30min后，紫外灯下观察结果，并照相保 留，根据电泳图结果确定mtDNA单个位点基因分型，基因型结果(mt8701A或G)由二者当中 的阳性反应确定。 图2是以3G和4A引物方案进行ARMS-PCR扩增后检测mtSNP 8701A/G的电泳图。 图中#1-6为6个不同样本，对每一样品，ARMS检测由对mtDNA8701A和G等位基因序列特异 性的两个ARMS扩增反应组成，点样次序为每个样品先4A后3G反应，基因型结果(mt8701A或mt8701G)由二者当中的阳性反应确定。200例不同标本的结果与通过PCR产物直接序 列分析法所获对应结果完全吻合。此外，对它们进行了三次独立检测，所有测试均显示确定 不变的mt8701G或A纯合子基因型，从而肯定了该方法的重现性、敏感性和可信度。图2中
M :100bp DNA分子量梯级标志物；_ :阴性对照。
实施例2 :对mtl0398A/G的检测 以前述可通过Bgl I酶切检测的mtSNP10398A/G的个体基因分型为例，针对其在 不同个体中A和G两种核苷酸的交替变化，进行了符合ARMS-PCR扩增原理的错配引物设 计，并使用优化的扩增条件对DNA样品进行基因分型检测。 发明人设计两对引物，共用的下游引物为(10398R): 5， -GGTGTTGAGGGTTATGAGAGTA-3，； 两条上游引物为错配的ARMS引物。上游ARMS引物1为(10398FG): 5， -GACTACAAAAAGGATTAGACA￡AG-3，； 上游ARMS引物2为(10398FA) :5， -GACTACAAAAAGGATTAGACA￡AA_3，。 上游引物3'末端碱基分别与A或G互补，同样在3'端倒数第3-4位增加连续错配
碱基，即引物序列中的下标处为引入的TG — AC错配，以达到增加引物与模板的结合难度、
降低扩增效率的目的。其余PCR步骤同具体实施例l，仅更换相应引物为10398R、10398FG
和10398FA，并增加模板总基因组DNA的用量为常规用量的大约5倍( 50ng/25uL)，其结
果与序列分析分型的结果相互吻合。
权利要求
一种用于mtDNA等位基因分型及点突变检测的ARMS-PCR方法，依次包括ARMS引物设计、ARMS-PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳、根据阳性反应确定基因型的步骤，其特征在于所述特异性ARMS适配引物设计步骤中，引物3’末端终止在待诊位点，在上游或下游ARMS引物3’倒数3-4位增加设置两个连续的碱基错配，错配方式为A-T或G-C的互换；所述ARMS-PCR扩增时增加模板mtDNA为常规用量的2～10倍。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于所述碱基错配方式为A-T或G-C的互换。
3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于所述ARMS适配引物为两对引物，共用上游 引物，两条下游引物分别在3'末端与待诊位点碱基匹配和错配，两条下游引物均在3'末端 倒数3-4位增加两个连续的碱基错配。
4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于所述ARMS适配引物为两对引物，共用下游 引物，两条上游引物分别在3'末端与待诊位点碱基匹配和错配，两条上游引物均在3'末端 倒数3-4位增加两个连续的碱基错配。
5. 如权利要求1 4所述之一的方法，其特征在于ARMS-PCR扩增时增加模板mtDNA 为常规用量的2 IO倍。
6. 如权利要求1 4所述之一的方法在检测mtDNA基因突变中的应用。
7. 如权利要求1 4所述之一的方法在检测mtSNPs中的应用。
全文摘要
一种用于mtDNA等位基因分型及点突变检测的ARMS-PCR方法，特异性ARMS引物设计时，上游引物或下游引物在3’末端倒数3-4位增加设置两个连续的碱基错配，错配方式为A-T或G-C的互换；ARMS-PCR扩增时增加模板mtDNA为常规用量的2～10倍。本发明通过改进ARMS-PCR，使其适用于mtDNA突变或mtSNPs等位基因分型检测。与现有mtDNA多态性或基因变异检测技术相比，本发明的方法不仅结果高度可靠，而且操作简便易行，并极大地加速了分析过程、降低了费用并减少了工作量。
文档编号C12Q1/68GK101768635SQ20091004241
公开日2010年7月7日 申请日期2009年1月5日 优先权日2009年1月5日
发明者周钢, 朱敏, 胡维新, 黄河 申请人:中南大学