专利名称：一种甄别dpyd基因*9a突变位点的pcr检测试剂盒及方法
技术领域：
本发明涉及一种甄别二氢嘧啶脱氢酶(dihydropyrimidinedehydrogenase，DPYD) 基因*9A突变位点实时荧光PCR检测试剂盒及检测方法。
背景技术：
化疗是临床恶性肿瘤治疗的三大手段之一，其主要应用的就是各类抗瘤机理，毒 性迥异的药物。5-氟尿嘧啶是一种氟化嘧啶类化疗药物，在临床上用于抗代谢抗肿瘤治疗， 对增殖性细胞均具有较好的杀伤效果。目前，该类药物已经广泛应用在临床多种肿瘤的治 疗领域，如胃肠道肿瘤、妇科肿瘤、头颈部肿瘤等。二氢嘧啶脱氢酶(dihydropyrimidine dehydrogenase, DPYD)基因编码的二氢嘧 啶脱氢酶是作用于5-FU药物代谢途径中的关键性酶之一，是分解代谢的限速酶，体内二氢 嘧啶脱氢酶含量的高低决定5-FU的代谢速度，进而影响体内药物的毒性和疗效。DPYD酶位 于1号人类染色体短臂上(1ρ22)，基因全长约1501Λ，含有31Λ的编码序列，由23个外显子 构成，长度从69bp到1404bp，基因中内含子由长短不等的序列组成。共编码1025个氨基 酸。5-FU药物代谢与DPYD多个基因多态性位点相关，*9A位点(T85C)基因多态性是其中 之一。文献报道表明多种疾病的人体易感性、药物代谢差异均与人类基因组中含有的基因 多态性相关，根据不同个体的差异制定合适的治疗方案是目前临床治疗的发展趋势。目前 已经明确二氢嘧啶脱氢酶与5-FU药物疗效有较高的相关性，针对酶活性检测的方法主要 以放射性标记结合HPLC法、mRNA表达等，但是这些方法操作比较麻烦，实验周期长。研究 表明DPYD基因含有40多种与5-FU分解代谢相关的基因多态性位点(其中DPYD*9A位点 (T85C)基因多态性在中国人群中报道较多)，大部分的检测方法仍然以基因直接测序方法 为主，一些分子生物学方法如基因芯片、DHPLC、PCR-SSCP, RFLP等已经应用到了 DPYD基因 多态性检测领域。高分辨率熔解曲线是近几年发展起来的分子生物学技术，是一种结合染 料法荧光定量PCR反应的分析方法，可以直观、有效地区分PCR产物中含有的基因多态性位 点ο
发明内容
本发明目的是根据二氢嘧啶脱氢酶基因*9A位点设计引物，提供一种甄别甄别二 氢嘧啶脱氢酶基因*9A突变位点(T85C)的实时荧光PCR检测试剂盒及其检测方法，可实现 对二氢嘧啶脱氢酶基因*9A突变位点快速、准确、特异分析。本发明采用的技术方案是一种甄别二氢嘧啶脱氢酶基因*9A突变位点实时荧光PCR检测试剂盒，所述试剂 盒主要包括特异性引物、Eva Green荧光染料、PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物和DNA聚 合酶，其特征在于所述特异性引物序列如下上游引物5‘ -CCTGGCTTTAAATCCTCGAACA-3 ‘下游引物5‘ -AGGATTTCTTTTCCAATGTTTC-3 ‘。
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本发明关键在于特异性引物的设计和检测的方法，试剂盒中其他组成，可按本领 域常规进行选择，该试剂盒可用作二氢嘧啶脱氢酶基因*9A突变位点的定性检测，也可加 入标准品进行定量检测。高分辨率熔解曲线技术(High Resolution Melting, HR )技术是近几年发展起 来的高精度分析方法，利用荧光定量PCR技术生成熔解曲线，通过读取其峰值可以将单个 碱基差别的序列进行特异性的鉴定。本发明选取含有二氢嘧啶脱氢酶基因*9A位点片段， 可通过荧光定量PCR和HR技术对二氢嘧啶脱氢酶基因*9A位点多态性进行准确区分。为达到定量检测的效果，所述试剂盒还可包括2种二氢嘧啶脱氢酶基因*9A位点 的阳性基因标准品，所述标准品序列如下二氢嘧啶脱氢酶基因*9A位点野生型标准品actcg agactgtaggcactgccatg gcccctgtgc tcagtaagga ctcggcggac atcgagagta tcctggcttt aaatcctcgaacacaaactc atgcaactct gtgttccact tcggccaaga aattagacaa gaaacattgg aaaagaaatcctgataagaa ctgctttaat tgtgagaagc tggagaataa ttttgatgac atcaagcaca cgactctt ；二氢嘧啶脱氢酶基因*9A位点突变型标准品actcg agactgtaggcactgccatg gcccctgtgc tcagtaagga ctcggcggac atcgagagta tcctggcttt aaatcctcgaacacaaactc atgcaactct gtgtcccact tcggccaaga aattagacaa gaaacattgg aaaagaaatcctgataagaa ctgctttaat tgtgagaagc tggagaataa ttttgatgac atcaagcaca cgactctt。一种甄别二氢嘧啶脱氢酶基因*9A突变位点的实时荧光PCR检测方法，所述方法 包括(1)提取待测样品DNA;(2)取特异性扩增引物、PCR缓冲液、Eva Green荧光染料、脱氧三磷酸核苷混合物 和DNA聚合酶，分别加入待测样品DNA或阴性对照品配成PCR反应体系，于同等条件下进行 PCR扩增反应，反应管置于定量荧光PCR仪进行荧光检测；所述特异性引物序列如下上游引物5‘ -CCTGGCTTTAAATCCTCGAACA-3 ‘下游引物5,-AGGATTTCTTTTCCAATGTTTC-3‘；(3)选择荧光检测模式FAM荧光对应波长，基线调整取3 15个循环的荧光信号， 以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；若待测样品荧光增长曲线超过阈值 线，并呈良好的对数增长，则判断为扩增反应阳性。为确定二氢嘧啶脱氢酶基因*9A位点类型，所述方法可同时以阳性基因野生型标 准品、突变型标准品和杂合型标准品DNA溶液在与样品DNA相同条件下进行PCR扩增反应， 扩增反应结束后，进一步以待测样品DNA、野生型标准品DNA、突变型标准品DNA和杂合型标 准品DNA的PCR扩增产物从75°C逐步升温到90°C，绘制溶解曲线，进行高分辨率溶解曲线 分析，结果与质粒标准品高分辨率溶解曲线结果进行比较，进而判定待检样品的类型；所述阳性基因标准品序列如下二氢嘧啶脱氢酶基因*9A位点野生型标准品actcg agactgtaggcactgccatg gcccctgtgc tcagtaagga ctcggcggac atcgagagta tcctggcttt aaatcctcgaacacaaactc atgcaactct gtgttccact tcggccaaga aattagacaa gaaacattgg aaaagaaatcctgataagaa ctgctttaat tgtgagaagc tggagaataa ttttgatgac atcaagcaca cgactctt ；
二氢嘧啶脱氢酶基因*9A位点突变型标准品actcg agactgtaggcactgccatg gcccctgtgc tcagtaagga ctcggcggac atcgagagta tcctggcttt aaatcctcgaacacaaactc atgcaactct gtgtcccact tcggccaaga aattagacaa gaaacattgg aaaagaaatcctgataagaa ctgctttaat tgtgagaagc tggagaataa ttttgatgac atcaagcaca cgactctt。二氢嘧啶脱氢酶基因*9A位点杂合型标准品为等摩尔量野生型标准品和突变型 标准品的混合物。熔解曲线对PCR产物加热，随着温度的升高，双链扩增产物逐渐解链，导致荧光 强度下降，到达某一温度时，会导致大量的产物解链，荧光急剧下降。利用该特点，由于不同 PCR产物序列的GC%不同导致其Tm值的不同，因此使其荧光信号发生迅速下降的温度也不 同，可通过对温度下降过程进行实时监控，进而此对PCR的特异性进行鉴定。所述方法同时以梯度浓度的阳性基因野生型标准品DNA溶液在与待测样品DNA相 同条件下进行PCR扩增反应，以标准品DNA溶液拷贝浓度的对数值为横坐标、标准品Ct值 为纵坐标绘制标准曲线；根据样品DNA测得的Ct值，对照相应阳性基因标准品的标准曲线， 获得样品DNA的拷贝浓度(突变型和杂合型均可以野生型标准品的标准曲线进行定量分 析)。所述PCR反应条件可按参照本领域常规荧光定量PCR方法，具体的，本发明中所述 PCR扩增反应条件如下95°C变性2分钟，95°C 15秒、60°C 45秒，进行45个循环。PCR反应液通常按如下组成配制(终浓度)1XPCR buffer、0. 5 μ M的引物、 IXEva GreenUU的DNA聚合酶、0. 2mM的dNTPs，通常取2μ L的模板，反应总体积通常为 20 μ L0本发明建立了利用染料荧光定量PCR结合高分辨率熔解曲线技术甄别二氢嘧啶 脱氢酶基因*9Α突变位点的方法，并经检测实际样本，表明该方法切实可行。由于本方法采 用了 PCR扩增和高分辨率熔解曲线技术，使得二氢嘧啶脱氢酶基因*9Α突变位点甄别的灵 敏度大大提高。本发明采用了目前较先进的定量PCR结合高分辨率熔解曲线技术，通过一次PCR 反应可以将二氢嘧啶脱氢酶基因*9Α突变位点类型进行准确甄别。基因序列中单碱基的 差异可以反应变性过程中解链时间的不同，进而可以通过高分辨率熔解曲线技术进行鉴 定。以前使用较多的染料法使用的均是不饱和染料，同时仪器的熔解曲线分辨率只能达到 1.0°C，不能满足单个碱基差异的区分。本发明使用的染料为Eva Green属于饱和染料，可 以真实的反应PCR片段的Tm值，而且目前所使用的荧光定量PCR仪器熔解曲线的精确度为 0. ore，因此可以对单个碱基的变化进行甄别。使得对于基因多态性位点通过一次PCR反 应进行鉴定，节省了实验的时间。本发明的有益效果主要体现在能够高灵敏度、高特异性、简便地对二氢嘧啶脱氢 酶基因*9A突变位点进行甄别，也可加入标准品进行定量检测和分析。
图1为二氢嘧啶脱氢酶基因*9A位点(T85C)三种类型(野生型、突变型和杂合 型)基因标准品的实时荧光定量PCR检测，A 实时荧光PCR扩增图，B:熔解曲线图，C:高分 辨率熔解曲线图；其中1 野生型，2 突变型，3 杂合型。
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图2为野生型质粒标准品实时荧光定量PCR标准曲线；从左至右分别为105、104、 103、102U0\l0°copies/ μ L 标准品。图3为野生型质粒标准品的实时荧光定量PCR标准曲线方程图；A为标准曲线为 Y = -3. 642Χ lgX+39. 79 ；Y 对应的CT值；X 野生型样本的copies ；B 熔解曲线图；C为高 分辨率熔解曲线图。图4为9例临床样本检测荧光定量PCR结果；A为荧光定量PCR扩增结果；；B为 熔解曲线结果；C为高分辨率熔解曲线结果。其中3例野生型、3例杂合型、3例突变型。Ct 值分别为 27. 99,28. 02,32. 36,29. 12,29. 45,29.86,27.73,27.89,30.05，对应的 copies 为 1. 73X IO3Copies/μ LU. 70X IO3Copies/μ LU X IO2Copies/μ L>8. 5X 102copies/μ L、 6. 92X 102copies/y L>5. 37 X 102copies/μ L、2. 04 X 103copies/μ LU. 86 X 103copies/ μ L、4. 78 X 102copies/μ L0
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此实施例1 1、材料人体血液基因组DNA提取试剂购自上海辉睿生物技术有限公司；PCR反应体系和 Taq DNA聚合酶购自上海辉睿生物技术有限公司，pGEM-T-Easy克隆系统购自Promage公 司、Eva Green染料购自上海辉睿生物技术有限公司，377型测序仪、Bio-Rad icycler PCR 仪，RotoGene 6000定量PCR仪为澳大利亚Corbett公司产品。2、引物合成以二氢嘧啶脱氢酶基因序列(注册号为MNOOOl 10)为模板，使用I^rimer 5. O软件 分析引物，从中选择最佳组合。检测用PCR引物序列如下上游引物5‘ -CCTGGCTTTAAATCCTCGAACA-3 ‘下游引物5‘ -AGGATTTCTTTTCCAATGTTTC-3 ‘测序用PCR引物序列如下Fl 5' -ACTCGAGACTGTAGGCACTG-3‘，Rl 5' -AAGAGTCGTGTGCTTGATGT-3‘均由上海辉睿生物技术有限公司合成。3、检测标准品制备选取ImL血液样本，用DNA提取试剂提取基因组DNA，取1. O μ 1 (50ng/ μ L)做PCR 反应模板，用前述引物(Fl和Rl)在Bio-Rad icyclerPCR仪上进行PCR扩增PCR反应液组成如下
2XPCR buffer10. Ομ L
引物 Fl (10 μ Μ)1 μ L
引物 Rl (10 μ Μ)1 μ L
DNA 聚合酶(5U/ μ L)0. 2μ L
dNTPs (各 250mM)1. 60 μ L(dATP、dTTP、dCTP、dGTP 物质的量比 1 1 1 1)模板 DNA (50ng/ μ L) 1 μ L水补足至20 μ L。PCR条件为94°C 5分钟变性，94°C 30秒、55°C 30秒、72°C 30秒进行35个循环扩 增，最后于72°C延伸5分钟后置40C0PCR产物经电泳检测后即用克隆系统插入pGEM-T-Easy克隆载体，并将阳性克隆 经测序验证，确认DPYD*9A位点突变类型，并采用重叠定点诱变扩增法构建对应另外类型 的标准质粒。回收223bp片段，即为野生型和突变型标准品，测定浓度并换算成(拷贝数/ 体积)。4、结果经测序，上述设计标准品完全与预期相符，回收的标准品片段序列如下二氢嘧啶脱氢酶基因*9A位点野生型标准品actcg agactgtaggcactgccatg gcccctgtgc tcagtaagga ctcggcggac atcgagagta tcctggctttaaatcctcga acacaaactc atgcaactct gtgttccact tcggccaaga aattagacaagaaacattgg aaaagaaatc ctgataagaa ctgctttaat tgtgagaagc tggagaataattttgatgac atcaagcaca cgactctt ；二氢嘧啶脱氢酶基因*9A位点突变型标准品actcg agactgtaggcactgccatg gcccctgtgc tcagtaagga ctcggcggac atcgagagta tcctggctttaaatcctcga acacaaactc atgcaactct gtgtcccact tcggccaaga aattagacaagaaacattgg aaaagaaatc ctgataagaa ctgctttaat tgtgagaagc tggagaataattttgatgac atcaagcaca cgactctt。实施例2 荧光定量PCR结合高分辨率熔解曲线法检测二氢嘧啶脱氢酶基因*9A 位点1、样本检测9例临床血液标本，采用基因组DNA提取试剂提取基因组DNA，分别取LOyL做模 板，用检测用上下游引物在Corbett公司RotoGene 6000型定量PCR仪上进行PCR扩增。PCR反应液组成如下IXPCR buffer2μ LMgCl22· 8 μ LIXEva Green2μ L上游引物(10μ Μ)IuL下游引物(10μ Μ)IuLDNA 聚合酶(5U/ μ L)0. 2 μ LdNTPs (各 250mM)1· 60 μ L(dATP、dTTP、dCTP、dGTP 物质的量比 1 1 1 1)模板 DNA (50ng/ μ L)1 μ L水补足至20 μ L。PCR反应条件为95°C预变性2分钟，95°C 15秒、60°C 45秒进行40个循环扩增， 75°C逐步升温到90°C，形成熔解曲线。以不含有该靶基因的非人源性细胞为阴性对照于相同条件下进行PCR检测，以阈
8值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；若待测样品荧光增长曲线超过阈值线， 并呈良好的对数增长，则判断为扩增阳性，否则判断为扩增阴性结果，扩增阳性的结果，通 过高分辨率熔解曲线与标准质粒结果相比较，确定样本类型。同时在相同条件下以不同浓度标准品进行检测，并绘制标准曲线。待测样本的测定结果经仪器处理根据标准曲线计算出检测样本中DPYD基因的 copies。按照上述方法，对各种不含有该靶基因的非人源性样品DNA(鼠源性Lewis肺癌细 胞株，或鼠源性B16黑色素瘤细胞株等)进行检测，结果均呈阴性，说明本发明方法特异性 好。按照上述方法，对三种类型模板(野生型、突变型和杂合型标准质粒)进行荧光定 量PCR检测，图1为标准质粒的荧光定量PCR扩增结果、熔解曲线结果和高分辨率熔解曲线结果。2、样品检测结果野生型质粒标准品检测结果参见图2，标准曲线及对应的熔解曲线、高分辨率熔解 曲线结果参见图3。9例临床样本检测荧光定量PCR结果参见图4，图4A为荧光定量PCR扩增结 果；图4B为熔解曲线结果；图4C为高分辨率熔解曲线结果。其中3例野生型、3例杂合 型、3 例突变型。Ct 值分别为 27. 99,28. 02,32. 36,29. 12,29. 45,29. 86,27. 73,27. 89、 30. 05，对应的 copies 为 1. 73 X 1O3Copies/μ L、1. 70 X 1O3Copies/μ L、1 X 1O2Copies/μ L、 8. 5Χ 1O2Copies/μ L、6. 92 X 1O2Copies/μ L、5. 37X 1O2Copies/μ L、2. 04Χ 1O3Copies/μ L、 1. 86Χ 1O3Copies/μ L、4. 78X 1O2Copies/μ L。本发明是结合最佳实施例进行描述的，然而在阅读了本发明的上述内容后，本领 域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求 书所限定的范围。
权利要求
1.一种甄别二氢嘧啶脱氢酶基因*9A突变位点实时荧光PCR检测试剂盒，所述试剂盒 主要包括特异性引物、Eva Green荧光染料、PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合 酶，其特征在于所述特异性引物序列如下上游引物5 ‘ -CCTGGCTTTAAATCCTCGAACA-3 ‘下游引物5 ‘ -AGGATTTCTTTTCCAATGTTTC-3 ‘。
2.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括2种二氢嘧啶脱氢 酶基因*9A位点的阳性基因标准品，所述标准品序列如下二氢嘧啶脱氢酶基因*9A位点野生型标准品actcg agactgtaggcactgccatg gcccctgtgc tcagtaagga ctcggcggac atcgagagta tcctggctttaaatcctcga acacaaactc atgcaactct gtgttccact tcggccaaga aattagacaagaaacattgg aaaagaaatc ctgataagaa ctgctttaat tgtgagaagc tggagaataa ttttgatgacatcaagcaca cgactctt ；二氢嘧啶脱氢酶基因*9A位点突变型标准品actcg agactgtaggcactgccatg gcccctgtgc tcagtaagga ctcggcggac atcgagagta tcctggctttaaatcctcga acacaaactc atgcaactct gtgtcccact tcggccaaga aattagacaagaaacattgg aaaagaaatc ctgataagaa ctgctttaat tgtgagaagc tggagaataa ttttgatgacatcaagcaca cgactctt。
3.—种甄别二氢嘧啶脱氢酶基因*9A突变位点的实时荧光PCR检测方法，所述方法包括(1)提取待测样品DNA；(2)取特异性扩增引物、PCR缓冲液、EvaGreen荧光染料、脱氧三磷酸核苷混合物和 DNA聚合酶，分别加入待测样品DNA或阴性对照品配成PCR反应体系，于同等条件下进行 PCR扩增反应，反应管置于定量荧光PCR仪进行荧光检测；所述特异性引物序列如下上游引物5 ‘ -CCTGGCTTTAAATCCTCGAACA-3 ‘下游引物5 ‘ -AGGATTTCTTTTCCAATGTTTC-3 ‘；(3)选择荧光检测模式FAM荧光对应波长，基线调整取3 15个循环的荧光信号，以阈 值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；若待测样品荧光增长曲线超过阈值线， 并呈良好的对数增长，则判断为扩增反应阳性。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述方法同时以阳性基因野生型标准品、突 变型标准品和杂合型标准品DNA溶液在与样品DNA相同条件下进行PCR扩增反应，扩增反 应结束后，进一步以待测样品DNA、野生型标准品DNA、突变型标准品DNA和杂合型标准品 DNA的PCR扩增产物从75°C逐步升温到90°C，绘制溶解曲线，进行高分辨率溶解曲线分析， 结果与阳性基因标准品高分辨率溶解曲线结果进行比较，进而判定待检样品的类型所述阳性基因标准品序列如下二氢嘧啶脱氢酶基因*9A位点野生型标准品actcg agactgtaggcactgccatg gcccctgtgc tcagtaagga ctcggcggac atcgagagta tcctggctttaaatcctcga acacaaactc atgcaactct gtgttccact tcggccaaga aattagacaagaaacattgg aaaagaaatc ctgataagaa ctgctttaat tgtgagaagc tggagaataa ttttgatgacatcaagcaca cgactctt ；二氢嘧啶脱氢酶基因*9A位点突变型标准品actcg agactgtaggcactgccatg gcccctgtgc tcagtaagga ctcggcggac atcgagagta tcctggctttaaatcctcga acacaaactcatgcaactct gtgtcccact tcggccaaga aattagacaagaaacattgg aaaagaaatc ctgataagaa ctgctttaat tgtgagaagc tggagaataa ttttgatgacatcaagcaca cgactctt ；二氢嘧啶脱氢酶基因*9A位点杂合型标准品为等摩尔量野生型标准品和突变型标准 品的混合物。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述方法同时以梯度浓度的阳性基因野生型 标准品DNA溶液在与待测样品DNA相同条件下进行PCR扩增反应，以标准品DNA溶液拷贝 浓度的对数值为横坐标、标准品Ct值为纵坐标绘制标准曲线；根据样品DNA测得的Ct值， 对照阳性基因标准品的标准曲线，获得样品DNA的拷贝浓度。
6.如权利要求3 5之一所述的方法，其特征在于所述PCR扩增反应条件如下95°C 变性2分钟，95°C 15秒、60°C 45秒，进行45个循环。
全文摘要
本发明提供了一种甄别二氢嘧啶脱氢酶基因*9A突变位点实时荧光PCR检测试剂盒，所述试剂盒主要包括特异性引物、Eva Green荧光染料、PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶，其特征在于所述特异性引物序列如下上游引物5′-CCTGGCTTTAAATCCTCGAACA-3′，下游引物5′-AGGATTTCTTTTCCAATGTTTC-3′。本发明的有益效果主要体现在能够高灵敏度、高特异性、简便地对二氢嘧啶脱氢酶基因*9A突变位点进行甄别，也可加入标准品进行定量检测和分析。
文档编号C12Q1/68GK102146440SQ20101061226
公开日2011年8月10日 申请日期2010年12月29日 优先权日2010年12月29日
发明者徐农, 方维佳, 牟海波, 郑怡 申请人:浙江大学