专利名称：人喉上皮癌细胞及制备方法与用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及人喉上皮癌细胞及制备方法与用途。
背景技术：
病毒性传染病是当今人类感染性疾病中的主要疾病。新近资料显示，近30年新发现的传染病中，已明确病原体的疾病中约有60%是由病毒引起的，而呼吸道疾病中约有50% 由病毒引起，其中的典例就是SARS冠状病毒和高致病性禽流感病毒。近年来在我国出现的 AIDS和SARS流行，给临床医学和病毒学研究提出了新的挑战。2003年以来在东南亚地区流行的高致病性禽流感受到全世界关注，我国亦有大批家禽和少数人受到感染。迄今我国共发生30例病人，其中死亡20例，病死率高达66. 7%。对人民的生命健康和财产造成直接的威胁和损失。包括禽流感和SARS在内的许多突发性呼吸系统传染病在临床上多以发热或重症肺炎的形式出现，需要依赖于病原学检查才能做出明确诊断。这些疾病的病死率高， 除了病毒本身具有高致病性外，诊断延误亦是一个重要原因。呼吸疾病严重威胁人们身体健康，在我国加强呼吸系统传染病的研究，尤其是临床病原诊断学的研究，已经成为社会发展面临的一种迫切要求。国内的临床实验室在临床病毒分离检测方面应当说是相当薄弱。大型城市的三甲医院都没有相应的实验室从事这一工作，而有条件的一些国家级研究所却更多关注的是基础病毒学的研究工作，缺乏临床病毒诊断方面的常规检验经验，存在着基础研究与临床应用脱节的现象。在一些大型儿科医院，虽有开展小规模的细胞病毒培养分离，但与国外临床病毒室的研究和应用相比差距甚大。在日常病毒培养上，国内大多数病毒实验室通常使用三种方法，包括将病毒接种在含有单层细胞玻璃管的细胞管培养法，将病毒直接接种在鸡胚中培养的鸡胚培养法以及病毒接种于多空板中进行培养的多空细胞板培养法。还有离心培养法病毒接种细胞后，通过对病毒离心接种，在CPE出现之前，以单克隆荧光抗体染色检测病毒复制早期产生的病毒抗原，从而达到敏感、快速的目的；在国外也出现了共培养细胞系统(R-Mix)，也可同时检出多种病毒。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术不足而提供一种能够抑制干扰素的作用、快速繁殖的人喉上皮癌细胞。一种人喉上皮癌细胞HEp-2-NSl，其保藏编号为CCTCC NO :C201092。该人喉上皮癌细胞HEp-2-NSl，于2010年10月15日提交中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO :C201092，并于2010年10月25日检测为存活。所述的人喉上皮癌细胞HEp-2-NSl含有质粒pBaBb-puro-NSl。本发明还提供了人喉上皮癌细胞HEp-2-NSl在快速增殖受感染病毒的应用。优选的，所述病毒为RSV病毒(Respiratory Syncytial Virus，呼吸道合胞病毒)、ADV病毒(Adenovirus,腺病毒)。本发明还提供了人喉上皮癌细胞HEP-2-NS1 (保藏编号为CCTCC NO :C201092)的制备方法，其包括如下步骤
(1)HEp-2细胞培养；
(2)NSl基因引物设计，扩增NSl基因；
(3)构建逆转录病毒载体pBabe-puro-NSl；
(4)转化及菌落PCR挑取阳性克隆，然后测序鉴定阳性克隆；
(5)提取质粒pBabe-puro-NSl ；
(6)包装产毒；
(7)收集病毒、保种；
(8)靶细胞培养；
(9)逆转录病毒感染靶细胞；
(10)筛选稳定感染细胞株，获得人喉上皮癌细胞HEp-2-NSl。干扰素是一类由病毒感染等外源刺激作用于细胞后，由细胞的特定反应形式产生的一类活性因子，它本身对病毒或其他感染源并无任何直接的作用能力，但它诱导其他未感染细胞进入一种反应状态，能够对新一轮感染表现不同程度的抵御作用，是一种早期的由细胞建立的宿主防御机制的表现形式。干扰素的作用过程干扰素通过与其他相应细胞表面的干扰素受体(IFNAR-1、 IFNAR-2、IFNGR-I、IFNGR-2)结合，从而诱导细胞产生一系列具有对细胞生理生化功能表现相应调节作用的大分子(蛋白激酶H(R、2’，5’寡腺苷酸合成酶0AS、RNA特异的腺苷脱氨酶 ADARl、Mx蛋白等)拮抗病毒的侵染，复制和转录过程。干扰素的产生实际上形成了对病毒的一种生存压力，这种压力必然会直接影响病毒结构及功能性质的进化，因此病毒通过表达一些拮抗蛋白来干扰IFN的诱导产生、IFN的信号传导或效应蛋白的作用，从而达到逃避或对抗干扰素的作用。很多研究表明，在RSV (呼吸道合胞病毒)感染的上皮细胞中RSV非结构蛋白NSl 是抑制I型干扰素作用的重要因素。NSl蛋白含有elongin-c和cullin-2结合序列，可使 NSl具有类似E3连接酶的作用，对调控蛋白酶的STAT-2进行降解。同时NSl蛋白通过调控干扰素调节因子3 (IRF-3)的磷酸化和转化入核来抑制I型干扰素对病毒感染的应答。 IRF-3能与STAT蛋白共同结合形成复合物而发挥转录调控子的作用，直接影响相关的干扰素功能蛋白的表达。STAT-JAK系统是干扰素作用的重要信号途径，控制干扰素调节基因和直接放大干扰素应答和上调基因的表达，以建立抗病毒状态和增强先天和适应性免疫反应。STAT即信号转导和转录激活子系统(包括STAT-I、STAT-2 STAT-3、STAT-4、STAT-5a, STAT-5b和STAT-6)，它的激活通过其结构中酪氨酸的磷酸化完成，而使其磷酸化的激酶系统即是JAK系统，即Janus酪氨酸激酶系统(包括JAK-1、JAK-2、JAK-3和 Κ-2)。这一 JAK 系统与干扰素的受体相偶联，一旦干扰素与其受体发生结合并导致多聚化之后，这一结构性的变化便会使JAK系统的有关成员激活，而发挥其酶活性。此激酶活性使相关的STAT成员磷酸化，后者在磷酸化后可以发挥其转录激活的作用。所以，发明人利用基因工程手段使宿主细胞内稳定产生NSl蛋白，降低干扰素对病毒复制的影响，打破宿主细胞自我保护与病毒感染之间的平衡，以达到快速感染病毒的效果。
图1为本发明实施例中经改良后的HEp-2-NSl细胞接种RSV病毒后第二天的细胞显微镜图2为本发明实施例中经改良后的HEp-2-NSl细胞接种RSV病毒后第四天的细胞显微镜图3为本发明实施例中没有改良的HEp-2细胞接种RSV病毒后第二天的细胞显微镜
图4为本发明实施例中没有改良的HEp-2细胞接种RSV病毒后第四天的细胞显微镜
图5为本发明实施例中经改良后的HEp-2-NSl细胞接种ADV病毒后第二天的细胞显微镜图6为本发明实施例中经改良后的HEp-2-NSl细胞接种ADV病毒后第四天的细胞显微镜图7为本发明实施例中没有改良的HEp-2细胞接种ADV病毒后第二天的细胞显微镜
图8为本发明实施例中没有改良的HEp-2细胞接种ADV病毒后第四天的细胞显微镜图。
具体实施例方式为使本发明更加容易理解，下面将进一步阐述本发明的具体实施例。实施例1
构建表达NSl基因的HEp-2细胞系方法
1)HEp-2细胞培养
2)NSl基因引物设计，扩增NSl基因
3)逆转录病毒载体构建(pBabe-puro-NSl)
4)转化及菌落PCR挑取阳性克隆
5)测序鉴定
6)质粒提取
7)包装产毒(293FT细胞培养，磷酸钙共转染表达质粒和包装质粒)
8)收集病毒、保种
9)靶细胞培养(改良前HEp-2细胞)
10)逆转录病毒感染靶细胞
11)筛选稳定感染细胞株(puro筛选稳定感染的HEp-2细胞)
12)稳定株扩增
逆转录病毒载体系统共由两部分组成包装细胞系(如细胞)和缺陷病毒本身 (逆转录病毒载体)。在逆转录病毒载体中，去除了正常的蛋白编码序列而保留了复制和包装信号，通过分子克隆技术将目的基因插入此载体上；而包装细胞系能提供病毒载体包装成病毒粒子所需的结构蛋白。当重组病毒载体导入包装细胞后，缺陷病毒载体和包装细胞的互补作用共同完成病毒装配，该病毒颗粒可感染其他宿主细胞，此时目的基因进入该细胞并整合到细胞基因组中，导致插入序列在宿主细胞中表达，产生目的蛋白。宿主细胞(HEp-2)不能像包装细胞Q93FT)那样为缺失结构基因的逆转录病毒提供结构蛋白，因而在宿主细胞内不会产生新的感染性病毒颗粒，保证了该载体的生物安全性问题。实施例2
构建表达NSl基因的HEp-2细胞系具体步骤 一、载体构建 1基因序列分析
对NCBI上已经提交的NSl基因序列(NCBI登录号为AF013254)进行分析，结果NS1 基因可用及丽W和进行酶切，置于启动子之后。pBaBb-puro表达载体为pBABE-Puro Retroviral Vector, CELL BIOLABS, INC。NSl基因编码序列分别为420bp，根据以上信息设计引物NSl-F和NS1-R。NS1基因的PCR扩增
根据NSl基因片断及引物的特征，设计PCR程序
20μ1 4μ1 μ μ μ 0. 3μ1 11. 7μ1 μ 。
反应体系 5XPrimeSTAR Buffer (Mg2+plus) 2. 5mM dNTP IOp upper弓丨物 IOp lower 引物 PrimeSTAR HS (2. 5υ/μ1) 灭菌水
模板(RSV病毒)反应条件 1. 95 0C 5min
2.98°C IOsec
3.58°C IOsec
4.72°C 30sec
5.72 °C5min
PCR反应结束后，反应液进行琼脂糖凝胶(1.5%)电泳检测反应产物，鉴定NS 1约为 420bpo产物的纯化
采用天根的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒从PCR产物中回收约420bp的目的片段。表达载体的构建
把NSl基因的胶回收产物和pBaBb-puro载体分别用私BamHl进行酶切后，用 TaKaRa的Τ4 DNA连接酶进行连接，转化大肠杆菌DH5 α，经过菌落PCR，酶切鉴定后送去英骏公司测序。
2、循环30次
6
4. 1 酶切
反应体系
50 μ 1体系
IQ XEcoRl buffer
5 μ 1 1 μ 1 1 μ 1
BamHl EcoRl
NSl 基因 / pBaBb-puro 灭菌水
20 μ 1/lul 23 μ l/42ul
反应条件37°C酶切2 hr
酶切产物用天根生化的PCR产物纯化试剂盒进行纯化回收。4. 2 连接
采用TaKaRa的T4 DNA连接酶，16°C连接过夜
连接体系中PCR纯化产物和载体的摩尔比采用3:1到8:1的连接比例，以此来调整连接体系中的PCR纯化产物所加的体积，来优化连接体系。感受态细胞制备及转化
感受态细胞制备采用常规制备方法，用的菌种是DH5 α。菌落PCR鉴定
以从含有Amp的LB平板上挑取的单菌落作为模板，进行菌落PCR检测，初步筛选到具有插入片段的克隆。测序
将鉴定出的阳性克隆送于英俊公司进行测序(测序引物为f^babeD,结果如下。氨基酸序列比对结果
结果有3个氨基酸发生突变第44位的A (丙氨酸)一V (缬氨酸)，第101位的L (亮氨酸)一S(丝氨酸)，第106位的D (天冬氨酸)一V (缬氨酸)。二、质粒少量扩增采用常规方法。三、氯化铯法大量提取质粒
3. 1将构建好的过表达载体pBabe-puro、pBabe-puro-NSl转化到STBL3感受态细胞
中
感受态制备，用的菌种是STBL3。(1)感受态细胞的制备 菌株活化
1)挑取一个单菌落，接种到3mLLB培养基中，于37°C培养过夜；
2)取30μ 1培养液接种到:3mL LB培养基中培养2 — 3小时，到0D600 = 0. 4 - 0. 5 ； 感受态细胞制备无菌、冰上、轻柔；
3)将培养液转入预冷的1.5mL离心管中，在冰上放置10min，4000rpm离心5min，弃上
清；
4)加入ImL预冷的0.lmol/1 CaCl2,悬浮沉淀，冰上预冷IOmin, 4000rpm离心5 min,
弃上清；
重复步骤4) 一次；
5)加入0.ImL预冷的0. lmol/1 CaC12，悬浮沉淀，即可使用。
7
(2) 转化的基本步骤
1)将100 μ 1感受态细胞于冰上解冻。幻取5μ 1连接产物加入到感受态细胞中，轻轻旋转几次以混勻内容物。在冰上放置30分钟。3)将管放入预加温到42°C的水浴中，热激90秒。快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却广2分钟。4)每管中加700 μ 1 LB培养基，37°C振荡培养45mirTl小时，进行复苏。5)室温4，OOOrpm离心5分钟，弃去上清后，用剩余100 μ 1培养基重悬细胞并涂布到含抗性的LB琼脂平板表面。注意细胞用量应根据连接效率和感受态细胞的效率进行调整。6)将平板置于室温直至液体被吸收。7)倒置平皿，于37°C培养，12^16小时后可出现菌落。大提步骤
1.挑取单克隆菌落至30mL LB中，含AMP，摇菌至0D600为0. 6。2.第二天从30mL菌液中取IOmL倒入1. OL的LB中，含AMP，37度摇过夜，0D600 为1.5-2. 0左右。3.收集细菌6000rpm，4°C离心 lOmin。4.重悬细菌加入32mL的Buffer I 保存，可含溶菌酶200mg)，用移液管吹打细菌，使其充分混勻，勿涡漩细菌。5.加入Buffer II 64mL (Buffer II现用现配)，上下颠倒混勻，冰上静置lOmin，充分裂解细菌，此过程可见到菌液变成粘稠澄清的液体。6.加入Buffer III 64mL (Buffer III现用现配)，上下颠倒使其充分混勻，冰上静置 IOmin07.去除蛋白6000rpm，4°C，离心 lOmin。8.四层纱布过滤去除蛋白杂质，在另一干净250mL离心瓶中收集过滤后的液体。9.加入 0. 6 倍体积的异丙醇(80mL)，8000rpm，4°C，离心 IOmin010.小心弃上清，待白色沉淀干燥后，用9. 5mLTE溶解白色沉淀。11.加入IlgCscl及ImLEB(储备液浓度10mg/mL)，待其充分溶解混勻后，8000rpm， 20°C离心IOmin(沉淀为蛋白和细菌碎片)。12. IOmL注射器小心吸取上清，避免吸入沉淀，转入超速离心管中，若装不满，用含 Cscl的TE液补满离心管，注意超速离心管中不能含有气泡，以免离心过程中破裂。13.封口，轻弹管壁，再次检查观众是否有气泡存在。14.确定管中没有起泡后，将超速离心管转入离心机中，每个离心管加上小红帽， 旋紧转头的盖子，装机。15. 65, OOOrpm, 20°C，离心Μ_4 ι，中途可停止离心机检查有无DNA带出现。16.取出离心管，固定，先在灌顶插入一注射器针头使其进入空气，用5mL注射器在DNA带的下缘斜上方插入，抽吸超螺旋DNA带至一 15mL干净离心管中。注意，此过程只能向外抽，不能向里吹，以免打散DNA，抽吸完成后，整理离心机，登记。17.向DNA液中加入等体积的水饱和正丁醇(4mL左右)剧烈摇晃均勻，然后20°C，5000rpm离心30sec，用干净毛细管吸气上层的正丁醇，反复多次萃取，直到DNA带中的红色除尽，萃取后的废弃的正丁醇要置于专门的废液瓶，以防污染环境。18.加入ImL的TE，在加入2. 5倍体积的无水乙醇，摇勻20°C，12000rpm，离心10 分钟。19.以lmL75%的乙醇加入Tube中，将沉淀吸入一 1.5mLEP管中，振荡30sec，离心 lmin，用移液枪移去上清，加入70%的乙醇反复3次，室温静置，使乙醇充分溶解DNA上的 Cscl ο20.最后在离心一次，尽量吸尽乙醇，在离心一次，去除壁上的乙醇，加入ImL灭菌TE溶解质粒沉淀，超净工作台中静置备用。21.紫外分光光度计测量质粒的浓度，做好标记。四、病毒包装和感染靶细胞
4. 1 磷酸钙法转染PIK包装质粒与pBabe-puro-NSl，pBabe-puro表达质粒于包装细胞产生病毒
1. 1 制备质粒混合物于1. 5mL EP中
ddH20 110 μ 1，IM CaCl2 50 μ 1，PIK (包装质粒)20 μ g，2XHBS 200 μ 1， / Babe-puro-NSl (/ Babe-puro)质f立 20 μ g。1. 2室温放置15-20min。
1. 3将质粒混合物均勻加入待转染细胞皿中，轻轻摇动使混勻。
1. 437°C孵箱 Mir。
1. 5弃掉培养基，PBS洗3次。
1. 6换新鲜培养基，37°C孵育过夜。
感染HEP-2细胞并筛选细胞
2. 1 IOmL无菌注射器吸取上清，后每3hr收集一次，共3_4次。2.2 每次吸取的上清以0.45 μ m的滤器过滤后感染HEp-2细胞，感染时加入 puro (2ug/mL)初筛3-7天，扩大培养。实施例3改良前后细胞对RSV病毒敏感性比较。材料
病毒=RSV B 株(购自 ATCC, lot:5271356)，梯度稀释至 KT1 一 1(Γ8 细胞改良前细胞ΗΕρ-2细胞，改良后细胞HEp-2-NSl细胞。方法
1.准备长至85%的改良前后的细胞；
2.PBS洗细胞面1-2次；
3.每孔加入50uL病毒稀释液后3000转，室温离心60分钟；
4.每孔加入50uL相应4%DMEM，放;34°C培养。观察2_4天。细胞病变(CPE)结果见图1、2、3、4。图中箭头所指为细胞病变。图中结果显示，经改良后的HEp-2-NSl细胞接种RSV病毒后，出现细胞病变的时间较没有改良的HEp-2细胞早，而且病变范围更广，所以能更早更容易观察感染情况，可以应用于临床病毒标本的快速培养与鉴定中。实施例4改良前后细胞对ADV病毒敏感性比较。
材料
病毒ADV 株(购自 ATCC, lot:7512088)，梯度稀释至 KT1 一 1(Γ8 细胞改良前细胞ΗΕρ-2细胞，改良后细胞HEp-2-NSl细胞。方法
1.准备长至85%的改良前后的细胞；
2.PBS洗细胞面1-2次
3.每孔加入IOOuL病毒稀释液后3000转，室温离心60分钟；
4.每孔加入IOOuL相应4%DMEM，放;34°C培养。观察5_6天。细胞病变(CPE)结果见图5、6、7、8。图中箭头所指为细胞病变。图中结果显示，经改良后的HEp-2-NSl细胞接种ADV病毒后，出现细胞病变的时间较没有改良的HEp-2细胞早，而且病变范围更广，所以能更早更容易观察感染情况，可以应用于临床病毒标本的快速培养与鉴定中。最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
权利要求
1.一种人喉上皮癌细胞HEp-2-NSl，其特征在于，其保藏编号为CCTCC NO :C201092。
2.根据权利要求1所述的人喉上皮癌细胞HEp-2-NSl，其特征在于，所述的人喉上皮癌细胞 HEp-2-NSl 含有质粒 pBaBb-puro-NSl。
3.根据权利要求1所述的人喉上皮癌细胞HEp-2-NSl在快速增殖受感染病毒的应用。
4.如权利要求1所述的人喉上皮癌细胞HEp-2-NSl的制备方法，其包括如下步骤(1)HEp-2细胞培养；(2)NSl基因引物设计，扩增NSl基因；(3)构建逆转录病毒载体pBabe-puro-NSl；(4)转化及菌落PCR挑取阳性克隆，然后测序鉴定阳性克隆；(5)提取质粒pBabe-puro-NSl ；(6)包装产毒；(7)收集病毒、保种；(8)靶细胞培养；(9)逆转录病毒感染靶细胞；(10)筛选稳定感染细胞株，获得人喉上皮癌细胞HEp-2-NSl。
全文摘要
本发明提供一种人喉上皮癌细胞HEp-2-NS1，其保藏编号为CCTCC NOC201092。本发明的人喉上皮癌细胞能够抑制干扰素的作用，快速繁殖。本发明还提供人喉上皮癌细胞的制备方法与用途。
文档编号C12N5/10GK102168070SQ20101061159
公开日2011年8月31日 申请日期2010年12月29日 优先权日2010年12月29日
发明者关文达, 占扬清, 周荣, 杨子峰, 王丹芬, 王玉涛, 秦笙, 莫自耀, 钟南山 申请人:呼吸疾病国家重点实验室, 广州呼研所医药科技有限公司