专利名称：用乙酰短杆菌的核苷磷酸化酶合成2’-脱氧鸟苷的方法
技术领域：
本发明涉及合成2’ -脱氧鸟苷的方法。
背景技术：
2’ -脱氧鸟苷是合成寡脱氧核苷酸等抗病毒、抗肿瘤核酸药物的重要原料。核苷类衍生物的传统制造方法大多采用化学合成法，此法的缺点是化学合成步骤多，难度高，周期长且有异构体产生。例如要对天然核苷进行化学修饰，往往需要先对碱基或核糖活性基团进行保护，反应结束后还要去除保护基团，这样合成反应的总收率将会降低。用化学法直接将碱基与核糖缩合，会形成α异构体，要获得与天然相同的化合物，往往需要复杂的分离方法，而且收率较低。化学合成要用到多种易燃易爆、有毒有害的有机溶剂，对环境的污染和对人身的伤害不容忽视。因此，近年来人们一直致力于生物酶法合成核苷及其类似物。酶法合成核苷药物， 不需要保护基团，具有较高催化效率和立体特异性，通常酶法生产的核苷均为结构。特别是嘌呤类核苷的化学合成远比嘧啶类核苷复杂和困难。所述2’-脱氧鸟苷亦可以DNA为原料，用核酸酶水解生成脱氧核苷酸，然后再用磷酸单酯酶水解，使其生成脱氧核苷，然后从中分离出2'-脱氧尿苷。此方法成本高，而且DNA来源有限，大量生产会受到限制。JP11-137290文献报道，日本横关键三等应用肺炎克雷伯氏菌 (Klebsillapneumoniae IF03321)核苷磷酸化酶的生产方法，但2，-脱氧鸟苷转化率仅为 28%。他在 Molecular Catalysis B =Enzymatic, 2000 (10)文献报道，使用产气肠杆菌 (Enterobacter aerogenesAJ-11125)为酶源，以2’ -脱氧尿苷和鸟苷为底物，2’ -脱氧鸟苷转化率仅为18%。其它亦有用胸苷和2、6_ 二氨基嘌呤生成2、6_ 二氨基2’-脱氧核苷， 再用腺苷脱氨酶处理得到2’ -脱氧鸟苷的方法，但路线太长，成本较高。
发明内容
本发明的目的是提供一种用乙酰短杆菌的核苷磷酸化酶合成2’ -脱氧鸟苷的方法，以克服现有技术存在的上述缺陷。本发明的方法，包括如下步骤(1)将乙酰短杆菌(Brevibacterium acetylicum)QD96-CGMCCNo· 04了2 接入培养
基进行培养，培养获得的菌体作为核苷酸磷酸化酶备用；所述培养基为常规的，其组分和重量含量包括牛肉膏1%，蛋白胨1%，酵母膏 0. 5%, NaCl 0. 5%，pH 为 7. 0 ；(2)然后将步骤(1)获得的菌体加入底物溶液，所述底物溶液中，脱氧核糖受体的含量为5 40mol/L，脱氧核糖供体浓度为5 40mol/L，磷酸缓冲液浓度为10 50mmol/ L，菌体的湿重加入重量为1 5%，40 65°C反应1 4h，离心，获得溶液含有2’-脱氧鸟苷的溶液，溶液经HPLC检测，2’-脱氧鸟苷的转化率达60%，然后从反应产物中收集2’-脱
氧鸟苷；
所述的脱氧核糖受体选自鸟嘌呤、鸟苷或鸟苷酸，但由于鸟嘌呤在水中溶解度较低，其中以鸟苷酸为最佳；所述的脱氧核糖供体选自2’ -脱氧核糖、2’ -脱氧核糖-1-磷酸，胸苷、2’ -脱氧尿苷或2’ -脱氧胞苷等，但从目前原料来源难易和价格因素考虑，选择胸苷、2’ -脱氧尿苷或脱氧核糖较好。所述的乙酰短杆菌(Brevibacterium acetylicum) QD96，在已保存于中国微生物菌种保藏管理委员会。保藏号为CGMCCNo. 0472，保藏日期为2000年7月5日，在中国专利 ZL 00125112.0中，该菌种的有关信息，已经进行了充分的描述，本发明不再赘述。HPLC检测条件色谱柱0DS2-C18柱(4. 6mmX250mm,5ym)流动相5(toimol/LKH2PO4(用H3PO4 调 ρΗ5· 5)和 10% 甲醇。V(KH2PO4) V(甲醇) =9:1。流速L0ml/min检测波长260nm进样量20μ 1柱温25°C。本发明使用乙酰短杆菌QD96的酶合成2’ -脱氧鸟苷，可低成本，高收率地获得 2’ -脱氧鸟苷，其转化率可达60%以上。
图1为脱氧鸟苷反应六种标准品HPLC图谱。图2为实施例1的脱氧鸟苷反应液1的HPLC图谱。
具体实施例方式实施例1在250ml三角瓶中装入50ml培养基，其中，含牛肉膏1%，蛋白胨1%，酵母膏 0. 5%,NaCl 0. 5%,pH 7. 0，于118°C灭菌30min，冷却后接入乙酰短杆菌QD96，于30°C振荡 (200r/min)培养16h，将培养液经4000r/min冷冻离心30min，再用0. 05mol/L磷酸盐缓冲液(PH7. 0)洗涤，再离心，所得之菌体冷藏保存，作为核苷酸磷酸化酶备用。在IOOml圆底烧瓶中，装入50ml底物溶液，其中含鸟苷酸和胸苷浓度各为40mol/ L，磷酸缓冲液为25mmol/L，菌体加入量为5% (湿重)，在恒温水浴中60°C搅拌反应池， 反应完毕，冷冻离心去除菌体和少量胸腺嘧啶沉淀物。然后将溶液经HPLC检测其中含 24mmol/L脱氧鸟苷，其转化率达60% (见图幻。经阴离子交换树脂分离，可获得0. 26g脱氧鸟苷。其中，阴离子交换树脂分离的方法，为公知的方法，在中国专利ZL98110601.3， ZL0213639. 2等中已经有详细的报道。实施例2在IOOml圆底烧瓶中装入50ml底物溶液，其中含鸟苷酸和2’-脱氧尿苷浓度各为 40mmol/L，磷酸缓冲液为25mmol/L，菌体加入量为5% (湿重)，以后操作同实施例1。将反应后溶液经HPLC检测，其中含^mmol/L脱氧鸟苷，其转化率65%。
权利要求
1.用乙酰短杆菌的核苷磷酸化酶合成2’-脱氧鸟苷的方法，其特征在于，包括如下步骤(1)培养乙酰短杆菌(Brevibacteriumacetylicum)QD96-CGMCCNo. 0472 ；(2)然后将步骤(1)获得的菌体加入底物溶液，所述底物溶液中，含有脱氧核糖受体、 脱氧核糖供体和磷酸缓冲液，反应，然后从反应产物中收集2’ -脱氧鸟苷。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的脱氧核糖受体选自鸟嘌呤、鸟苷或鸟苷酸，所述的脱氧核糖供体选自2’ -脱氧核糖、2’ -脱氧核糖-1-磷酸，胸苷、2’ -脱氧尿苷或2’ -脱氧胞苷。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的脱氧核糖受体为鸟苷酸，所述的脱氧核糖供体为胸苷、2’ -脱氧尿苷或脱氧核糖。
4.根据权利要求1 3任一项所述的方法，其特征在于，所述底物溶液中，脱氧核糖受体的含量为5 40mol/L，脱氧核糖供体浓度为5 40mol/L，磷酸缓冲液浓度为10 50mmol/L，菌体的湿重加入重量为1 5%，40 65°C反应1 4h。
全文摘要
本发明提供了一种应用乙酰短杆菌的核苷磷酸化酶合成2’-脱氧鸟苷的方法，包括如下步骤(1)培养乙酰短杆菌(Brevibacterium acetylicum)QD96-CGMCCNo.0472；(2)然后将步骤(1)获得的菌体加入底物溶液，所述底物溶液中，含有脱氧核糖受体、脱氧核糖供体和磷酸缓冲液，反应，然后从反应产物中收集2’-脱氧鸟苷。本发明使用乙酰短杆菌QD96的酶合成2’-脱氧鸟苷，可低成本，高收率地获得2’-脱氧鸟苷，其转化率可达60％以上。
文档编号C12P19/32GK102174618SQ20101061173
公开日2011年9月7日 申请日期2010年12月29日 优先权日2010年12月29日
发明者周长林, 曹静, 李喻, 邱志云, 邱蔚然, 陆长德 申请人:南通秋之友生物科技有限公司, 江苏秋之友核酸药物工程技术研究中心有限公司