专利名称：5＇核苷酸酶诊断试剂盒及5＇核苷酸酶活性浓度测定方法
技术领域：
本发明涉及一种5'核苷酸酶诊断试剂盒，同时本发明还涉及测 定5'核苷酸酶活性浓度的方法，属于医学检验测定技术领域。
背景技术：
医学研究表明，5' -核苷酸酶(5' NT)增高主要见于阻塞性黄胆， 也可见于肝癌和肝炎。在胆汁淤枳并发胆管炎、原发性和继发性胆汁 性肝硬化和慢性肝炎时，5' NT升高率高于碱性磷酸酶；肝肿瘤和肝 肉芽肿时5' NT升高的敏感性高于碱性磷酸酶。因为5'-核苷酸酶活 性无生理性升高，对于诊断婴幼儿肝病和妊娠性肝功胆汁淤积较碱性 磷酸酶不但敏感，而且有特异性。因此测定5'-核苷酸酶的活性对于 疾病的诊断具有重要意义。
5'-核苷酸酶的活性测定力'法很多，主要有同位素底物法、化学 强酸测磷法(1925年)。据申请人了解，目前国际上普遍采用同位素 底物测试法，方法为5'-核苷酸酶作用于H'-dUMP，终止反应后，通 过离子交换层析柱分析结果，求得5'-核苷酸酶活性。或者利用5' _ 核苷酸酶作用于单磷酸腺苷后产生无机磷，再用化学强酸法分析无机 磷含量得以计算出5'-核苷酸酶的活性。
同位素底物法方法复杂还有同位素污染，而且需要同位素测定仪， 因此难以切实推广应用。无机磷测定法是i925年发明的方法，准确度 不好，强酸污染环境等等，也不适合推广应用
发明内容
本发明要解决的技术问题是提出 一 种禾lj用酶循环扩增法
(Enzymatic Recycling Method )、 酶比色法'(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)联法(Co叩le Reaction)技术，连续监测还原型 烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340m"波长处吸光度的变化，得以测定 5'核苷酸酶活性浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法 的5'核苷酸酶诊断试剂盒，采用该试剂盒不仅可以在紫外/可见光分 析仪或半、全自动生化分析仪上进行5'核苷酸酶活性浓度测定，而 且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。 .本发明5'核苷酸酶活性浓度测定方法原理如下
腺苷单磷酸+水 5'核-fl酸酶 腺苷+磷酸根 腺苷+水腺苷脱氨酶肌苷+氨离子 氨离子+丙酮酸+还原型辅酶 丙氨酸脱氢酶 L-丙氨酸
+水+辅酶
丙氨酸+水+氧 甘氨酸氧化酶氨离子+内酮酸+
过氧化氢
.5'核苷酸酶及腺苷脱氨酶作为作用酶，功能为将腺苷单磷酸经二 步酶解产生氨离子。丙氨酸脱氢酶(alanine dehydrogenase : EC 1.4丄1) 作为显色酶，利用氨离子和丙酮酸使还原型辅酶变成为辅酶，在340nm 波长下发生吸光度下降，从而可以测算出5'核苷酸酶的活性浓度， 同时丙氨酸脱氢酶的酶促反应产生丙氨酸。甘氨酸氧化酶(glycine oxidase ; EC 1.4.3.19)作为循环酶片氨酸氧化酶的酶促作用再将丙 氨酸再次变回氨离子，使氨离子不断地被重复循环利用。 实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考 虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明5'核苷酸 酶诊断试剂盒较为理想
缓冲液 稳定剂 还原型辅酶 腺苷脱氨酶
甘氨酸氧化酶
腺苷单磷酸
丙酮酸
100 mmol/L 50 mmol/L 0.25 mmol/L 6000 U/L 10000 U/L 12000 U/L 6 mmol/L 12 mmol/L
本发明的5'核苷酸酶诊断试剂盒可以是单剂，包括
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、腺苷单磷酸、丙酮酸、腺苷脱 氨酶、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶。
试剂盒可以是干粉状态，在使用 液体试剂，直接使用。
溶解后使用；也Bj以配制成
也可以将上述单剂试剂配成如卜一双剂试剂 试剂1
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、腺苷单磷酸、丙酮酸'
试剂2
缓冲液、稳定剂、腺苷脱氨酶、丙氨酸脱氢酶、汁氨酸氧化
还原型辅酶、腺苷单磷酸、丙酮酸、腺佇脱氨酶、丙氨酸脱氢酶、 甘氨酸氧化酶在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干 粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使 用。
还可以将上述单剂试剂配成如7三剂试剂 试剂l
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶。
试剂2
缓冲液、稳定剂、腺苷单磷酸、丙酮酸。 试剂3
缓冲液、稳定剂、腺苷脱氨酶、丙氨酸脱氢酶、付氨酸氧化酶。
还原型辅酶、腺苷单磷酸、丙酮酸、腺苷脱氨酶、丙氨酸脱氢酶、 甘氨酸氧化酶在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂盒 可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂， 直接使用。
'无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定5'核苷酸酶活性浓度的 方法，其还原型辅酶可以是NADPH、NADH或thio- NADH中的一种。
具体实施例方式
下面结合实施例子对本发明作进 一 歩的说明。 实施例一
本实施例的5'核苷酸酶诊断试剂为单试剂，包拈
(羧甲基)氨基甲烷--盐酸缓冲液 1()0mmol/L
稳定剂
还原型辅酶
腺苷脱氨酶
丙氨酸脱氢酶
甘氨酸氧化酶
腺苷单磷酸
丙酮酸
50 mmol/L 0.25 mmol/L 6000 U/L
12000 U/L 6 mmol/L 12 mmol/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂； 使用前，加入纯净水，复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定温度37。C，反应时间10分钟，起始 吸光度1.8士0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测5'核 苷酸酶样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为负反应(—F降反应)， 延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右，理论K值一4180。
加入样品和试剂后，使之混合许发生反应，最终将反应物置于生化
分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，
苷酸酶的活性浓度大小。
实施例二
本实施例的5'核苷酸酶诊断/测定试剂为双试剂，包括:
l算出5'核
试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷一盐f
100 mmol/L
稳定剂
50 mmol/L
还原型辅酶 腺苷单磷酸
丙酮酸
0.25 mmol/L 4 mmol/L 16 mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基屮烷一盐酸缓冲液 H)0mmol/L
稳定剂 腺苷脱氨酶 丙氨酸脱氢酶 甘氨酸氧化酶
50 mmol/L 4000 U/L 12000 U/L 16000 U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。
在全自动生化分析仪上设定温度37"C，反应时间10分钟，起始
吸光度1.8士0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测5'核 苷酸酶样品与试剂l、试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为负反应 (下降反应)，延迟时间大约l分钟左右，检测时间2分钟左右，理论 K值一2170。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化
分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出:
苷酸酶的活性浓度大小。
实施例三
本实施例的5'核苷酸酶诊断Z测定试剂为三试剂，包括 试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷—盐酸缓冲液 100mmol/L
,核
稳定剂 还原型辅酶
试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液
稳定剂
腺苷单磷酸
50 mmol/L 0.25 mmol/L
丙酮酸
100 mmol/L 50 mmol/L 10 mmol/L 8 mmolAL
试剂
(羧甲基)氨基屮烷一盐酸;
稳定剂 腺苷脱氨酶 丙氨酸脱氢酶 甘氨酸氧化酶
100 mmol/L 50 mmol/L 訓0 U/L 8000 U/L ■0 U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。 测定5'核苷酸酶活性浓度时，在全自动生化分析仪上设定温度
37°C，反应时间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm， 测试副波长405nm，被测5'核苷酸酶样品与试剂l、忒剂2、试剂3 的体积比例为4/40/5/5，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大 约1分钟左右，检测时间2分钟左右，理论K值一2170。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化
分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度， 苷酸酶的活性浓度大小。
出5'核
总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分 析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，便于推广应
用o
权利要求
1.一种酶循环扩增法、酶比色法的5′核苷酸酶活性浓度测定方法，其方法原理如下id="icf0001" file="A2006100972570002C1.gif" wi="133" he="59" top= "48" left = "38" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="no"/>将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，测算出5′核苷酸酶的活性浓度大小测定结果。
2. —种5'核苷酸酶诊断试剂盒，卞要成分包括缓冲液20——500 mmol/L稳定剂l一50 mmol/L还原型辅酶O.l —0.35 mmol/L腺苷脱氨酶1000——-80000 U/L丙氨酸脱氢酶1000——-80000 U/L甘氨酸氧化酶1000——-80000 U/L腺苷单磷酸卜12 mmol/L丙酮酸25 mmol/L其特征在于试剂盒可以足千粉状态，在使用前加水溶解后使用;也可以配制成液体试剂，直接使用。
3. 根据权利要求2所述5'核苷酸酶诊断试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、腺苷单磷酸、丙酮酸、腺苷脱氨 .酶、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶组成单剂试剂。
4. 根据权利要求2所述5'核苷酸酶诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、腺苷单磷酸、丙酮酸、腺苷脱氨酶、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶组成双剂试剂；试剂l，由缓冲 液、稳定剂、还原型辅酶、腺苷单磷酸、丙酮酸组成；试剂2，由 缓冲液、稳定剂、腺苷脱氨酶、W氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶组成。 还原型辅酶、腺苷单磷酸、丙酮酸、腺苷脱氨酶、丙氨酸脱氢酶、 .甘氨酸氧化酶在试剂1或试剂2中的位置可以不限。
5. 根据权利要求2所述5'核苷酸酶诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、腺苷单磷酸、丙酮酸、腺苷脱氨 酶、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶组成多剂试剂；试剂l，由缓冲 液、稳定剂、还原型辅酶、组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、腺 苷单磷酸、丙酮酸组成；试剂3，由缓冲液、稳定剂、腺苷脱氨酶、 丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶组成。还原型辅酶、腺苷单磷酸、丙 酮酸、腺苷脱氨酶、丙氨酸脱^酶、计氨酸氧化酶在试剂l、试剂 2或试剂3中的位置可以不限。
6. 根据权利要求2所述5'核昔酸酶诊断试剂盒，其特征在于还包 括稳定剂1~4000 mmol/L或0.1%-100%体积比。所述稳定剂为 硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol),丙二醇(PropyleneGlycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。
全文摘要
本发明涉及一种利用酶循环扩增法、酶比色法及酶联法技术的5′核苷酸酶诊断试剂盒，同时本发明还涉及测定5′核苷酸酶活性浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括缓冲液、还原型辅酶、腺苷单磷酸、丙酮酸、腺苷脱氨酶、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度下降的速度，从而测算出5′核苷酸酶的活性浓度大小。采用本发明完全可以通过紫外/可见光分析仪器得出所需的测定结果。
文档编号G01N21/77GK101169379SQ20061009725
公开日2008年4月30日 申请日期2006年10月26日 优先权日2006年10月26日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司