专利名称：5＇核苷酸酶诊断试剂盒及5＇核苷酸酶活性浓度测定方法
技术领域：
本发明涉及一种5'核苷酸酶诊断试剂盒，同时本发明还涉及测 定5'核苷酸酶活性浓度的方法，属于医学检验测定技术领域。
背景技术：
医学研究表明，5'-核苷酸酶(5' NT)增高主要见于阻塞性黄胆， 也可见于肝癌和肝炎。在胆汁淤积并发胆管炎、原发性和继发性胆汁 性肝硬化和慢性肝炎时，5' NT升高率高于碱性磷酸酶；肝肿瘤和肝 肉芽肿时5' NT升高的敏感性高于碱性磷酸酶。因为5'-核苷酸酶活 性无生理性升高，对于诊断婴幼儿肝病和妊娠性肝功胆汁淤积较碱性 磷酸酶不但敏感，而且有特异性。因此测定5'-核苷酸酶的活性对于 疾病的诊断具有重要意义。
5'-核苷酸酶的活性测定方法很多，主要有同位素底物法、化学 强酸测磷法(1925年)。据申请人了解，目前国际上普遍采用同位素 底物测试法，方法为5'-核苷酸酶作用于tf-dUMP，终止反应后，通 过离子交换层析柱分析结果，求得5'-核苷酸酶活性。或者利用5'-核苷酸酶作用于单磷酸腺苷后产生无机磷，再用化学强酸法分析无机 磷含量得以计算出5'-核苷酸酶的活性。
同位素底物法方法复杂还有同位素污染，而且需要同位素测定仪， 因此难以切实推广应用。无机磷测定法是1925年发明的方法，准确度 不好，强酸污染环境等等，也不适合推广应用
发明内容
本发明要解决的技术问题是提出一种利用酶循环扩增法
(Enzymatic Recycling Method)、 酶比色 去(Enzymatic Colorimetric Method)及酶联法(Couple Reaction)技术，连续监测通过酶联反应 生成吲嗒胺色原(Indamine dye)或醌亚胺色原(Quioneimine dye)， 所导致在400——700nm波长处吸光度的上升，得以测定5'核苷酸酶 活性浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的5'核苷 酸酶诊断试剂盒，采用该试剂盒不仅可以在可见光分析仪或半、全自 动生化分析仪上进行5'核苷酸酶活性浓度测定，而且测定速度快、 灵敏度大、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。 本发明5'核苷酸酶酶活性浓度测定方法原理如下 腺苷单磷酸+水5'核苷酸酶腺苷+磷酸根 腺苷+水腺苷脱氨酶肌苷+氨离子 氨离子+丙酮酸+还原型辅酶丙氨酸脱氢酶 L-丙氨酸
+水+辅酶
丙氨酸+水+氧甘氨酸氧化酶氨离子+丙酮酸+
过氧化氢
过氧化氢+还原型色原体组合过氧化物酶喷嗒胺色原或
醌亚胺色原+水
5'核苷酸酶(5，nucleotidase ; EC3丄3.5)、腺苷脱氨酶(adenosine deaminase ; EC 3.5.4.4)及丙氨酸脱氢酶(alanine dehydrogenase ; EC 1.4丄1)作为作用酶，功能为将腺苷单磷酸经三步酶解产生丙氨酸。 甘氨酸氧化酶(glycine oxidase ; EC 1.4.3.19)作为循环酶甘氨酸氧
化酶的酶促作用将丙氨酸再次变回氨离子及丙酮酸，使氨离子及丙酮 酸不断地被重复循环利用，并不断地循环产生过氧化氢。过氧化物酶
(peroxidase ; EC 1.1L1.7)作为显色酶，最终通过和过氧化氢的作用 将无色的还原型色原体组合氧化成有色的染料，从而可以通过可见光 分析仪器，在400—700nm (根据还原型色原体组合的不同而定)波长 处，测定染料，吲嗒胺色原(Indamine dye)或醌亚胺色原(Quioneimine dye)，含量高低的光吸收大小，通过测量400—700nm (根据还原型色 原体组合的不同而定)处吸光度上升的速度，可以测算5'核苷酸酶 的活性浓度大小。
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考 虑，如下成分关系的本发明5'核苷酸酶诊断试剂盒较为理想
缓冲液
稳定剂
过氧化物酶
还原型辅酶
腺苷脱氨酶
甘氨酸氧化酶 腺苷单磷酸
丙酮酸
还原型色原体组合
腦mmol/L 50 mmol/L 30000 U/L 0.25 mmol/L 6000 U/L 8000 U/L 12000U/L 8 mmol/L 16 mmol/L 0.1——20 mmol/L
所述还原型色原体组合(Chromogen)可以是下列28个组合中的任一
个组合配对
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 石碳酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N-乙基^N. G-硫丙基)-m-噻啶胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 N,N-双乙基-m-甲苯胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2,4-双氯石碳酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2，4,6-仨溴-3-羟基-苯磺酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 3，5-双氯石碳酸磺酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 3，5-双氯-2-羟基-苯磺酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 仨溴羥基苯甲酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 双甲基苯胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
2，2，-AZINO-双(3-乙基苯噻哗-6-磺酸)
3- 甲基-2-苯噻唑酮腙
4- 羥基-3-甲氧基苯甲酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 3-甲基-乙基-羥基苯胺
4-氨基抗砒 石碳酸
4-氨基抗砒
]^乙基^>^- (3-硫丙基)-m-噻啶胺
4-氨基抗砒 N，N-双乙基-m-甲苯胺
4-氨基抗砒 2，4-双氯石碳酸
4-氨基抗砒
2，4,6-仨溴-3-羟基-苯磺酸
4-氨基抗砒 3，5-双氯石碳酸磺酸
4-氨基抗砒
3，5-双氯-2-羟基-苯磺酸 4-氨基抗砒
N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐
4-氨基抗砒 仨溴羥基苯甲酸
4-氨基抗砒 双甲基苯胺
4-氨基抗砒
N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺 4-氨基抗砒
2,2，-AZINO-双(3-乙基苯噻啤-6-磺酸) 4-氨基抗砒
4-羥基-3-甲氧基苯甲酸 4-氨基抗砒
3-甲基-乙基-羥基苯胺。 本发明的5'核苷酸酶诊断试剂盒可以是单剂，包括
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、腺苷单磷酸、丙酮酸、腺苷脱氨酶、
丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶、过氧化物酶、还原型色原体组合。
试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液
体试剂，直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂 试剂1
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、腺苷单磷酸、丙酮酸、还原型 色原体组合。
试剂2
缓冲液、稳定剂、过氧化物酶、腺苷脱氨酶、丙氨酸脱氢酶、 甘氨酸氧化酶。
过氧化物酶、还原型色原体组合、还原型辅酶、腺苷单磷酸、丙酮 酸、腺苷脱氨酶、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶在试剂1或试剂2中 的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用; 也可以配制成液体试剂，直接使用。
还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂 试剂l
缓冲液、稳定剂、还原型色原体组合、还原型辅酶。
试剂2
缓冲液、稳定剂、还原型色原体组合、丙酮酸、腺苷单磷酸。 试剂3
缓冲液、稳定剂、过氧化物酶、腺苷脱氨酶、丙氨酸脱氢酶、 甘氨酸氧化酶。过氧化物酶、还原型色原体组合、还原型辅酶、腺苷单磷酸、丙酮 酸、腺苷脱氨酶、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶在试剂1、试剂2或
试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶 解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
具体实施例方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。
实施例一
本实施例的5'核苷酸酶诊断试剂为单试剂， 三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 稳定剂 还原型辅酶 过氧化物酶 腺苷脱氨酶 丙氨酸脱氢酶 甘氨酸氧化酶 腺苷单磷酸 丙酮酸 4-氨基抗砒 石碳酸
包括 100 mmol/L 50 mmol/L 0.25 mmol/L 30000 U/L 6000 U/L 8000 U/L 12000U/L 8 mmol/L 16 mmol/L 2 mmol/L 10 mmol/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂; 使用前，加入纯净水，复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定温度37X:，反应时间10分钟，坝
试主波长505nm，测试副波长600nm，被测5'核苷酸酶样品与试剂 的体积比例为1/25，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约l 分钟左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化 分析仪下，检测主波长505nm吸光度上升的速度，从而测算出5'核 苷酸酶的活性浓度大小。 实施例二
本实施例的5'核苷酸酶诊断试剂为双试剂，包括
试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 10Ommol/L 稳定剂 50 mmol/L
还原型辅酶 腺苷单磷酸 丙酮酸
2，4，6-仨溴-3-羟基-苯磺酸
0.25 mmol/L 6 mmol/L 20 mmol/L 0.2 mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液
稳定剂
过氧化物酶
腺苷脱氨酶
甘氨酸氧化酶
100 mmol/L 50 mmol/L 30000 U/L 8000 U/L 8000 U/L 16000U/L
4-氨基抗砒 0.6 mmol/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37"C，反应时间10分钟，测试
主波长546nm，测试副波长600nm，被测5'核苷酸酶样品与试剂的
体积比例为1/20，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约l分
钟左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化
分析仪下，检测主波长546nm吸光度上升的速度，从而测算出5'核
苷酸酶的活性浓度大小。
实施例三
本实施例的5'核苷酸酶诊断试剂为三试剂，包括 试剂l
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 10Ommol/L
稳定剂
还原型辅酶
双甲基苯胺
50 mmol/L 0.25 mmol/L 2 mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液
稳定剂
腺苷单磷酸
丙酮酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
100 mmol/L 50 mmol/L 5 mmol/L 20 mmol/L 0.6 mmol/L
试剂3
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 50 mmol/L
过氧化物酶 30000 U/L
腺苷脱氨酶 8000 U/L
丙氨酸脱氢酶 10000 U/L
甘氨酸氧化酶 10000 U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37'C，反应时间10分钟，测试 主波长578nm，测试副波长660nm，被测5'核苷酸酶样品与试剂的 体积比例为1/30，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约l分 钟左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化 分析仪下，检测主波长578nm吸光度上升的速度，从而测算出5'核 苷酸酶的活性浓度大小。
申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他各种还原 型色原体组合均能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实 施例类同，不另一一例举。
总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过可见光分 析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，不受内外源 物质量污染。
权利要求
1.一种酶循环扩增法、酶比色法及酶联法技术的5′核苷酸酶活性浓度测定方法，其方法原理如下id="icf0001" file="A2006100972540002C1.gif" wi="133" he="81" top= "49" left = "38" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="no"/>将最终反应物置于可见光分析仪下，检测400-700nm处直接反映吲嗒胺色原或醌亚胺色原含量高低的光吸收大小，得出5′核苷酸酶活性浓度大小测定结果。
2. 一种5'核苷酸酶诊断试剂盒, 主要成分包括:缓冲液 20-50 mmol/L稳定剂 1-50 mmol/L还原型辅酶 0.1-0.35 mmol/L腺苷脱氨酶 1000-80000 U/L丙氨酸脱氢酶 1000-80000 U/L甘氨酸氧化酶 1000-80000 U/L过氧化物酶 500-80000 U/L腺苷单磷酸 1——16mmol/L丙酮酸 1- 50mmol/L还原型色原体组合 0.1——20 mmol/L其特征在于试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。3. 根据权利要求2所述5'核苷酸酶诊断试剂盒，其特征在于 由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、腺苷单磷酸、丙酮酸、腺苷脱氨 酶、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶、过氧化物酶、还原型色原体组 合组成单剂试剂。4. 根据权利要求2所述5'核苷酸酶诊断试剂盒，其特征在于-由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、腺苷单磷酸、丙酮酸、腺苷脱氨 酶、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶、过氧化物酶、还原型色原体组 合双剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、腺苷单磷 酸、丙酮酸、还原型色原体组合组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、 腺苷脱氨酶、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶、过氧化物酶组成。过 氧化物酶、还原型色原体组合、还原型辅酶、腺苷单磷酸、丙酮酸、 腺苷脱氨酶、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶在试剂1或试剂2中的 位置可以不限。5. 根据权利要求2所述5'核苷酸酶诊断试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、腺苷单磷酸、丙酮酸、腺苷脱氨 酶、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶、过氧化物酶、还原型色原体组 合组成多剂试剂；试剂l，由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、还原型色原体组合组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、腺苷单磷酸、丙 酮酸、还原型色原体组合组成；试剂3,由缓冲液、稳定剂、腺苷 脱氨酶、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶、过氧化物酶组成。过氧化 物酶、还原型色原体组合、还原型辅酶、腺苷单磷酸、丙酮酸、腺 苷脱氨酶、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶在试剂l、试剂2或试剂 3中的位置可以不限。6. 根据权利要求2所述5'核苷酸酶诊断试剂盒，其特征在于还 包括稳定剂l"4000mmol/L或0.1。/Q-100。/。体积比。所述稳定剂为 硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。7. 根据权利要求2所述5'核苷酸酶诊断试剂盒，其特征在于所述还原型色原体组合可以是下列28个组合中的任一个组合3-甲基-2-苯噻唑酮腙 石碳酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基一N- (3-硫丙基)-m-噻啶胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙 N，N-双乙基-m-甲苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2，4-双氯石碳酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2,4,6-仨溴-3-羟基-苯磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 3,5-双氯石碳酸磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 3，5-双氯-2-羟基-苯磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐3-甲基-2-苯噻唑酮腙 仨溴羥基苯甲酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 双甲基苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙2，2，-AZINO-双(3-乙基苯噻哞-6-磺酸)3- 甲基-2-苯噻唑酮腙4- 羥基-3-甲氧基苯甲酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙3- 甲基-乙基-羥基苯胺4- 氨基抗砒 石碳酸4-氨基抗砒N-乙基^N. (3-硫丙基)-m-噻啶胺4-氨基抗砒 N，N-双乙基-m-甲苯胺4-氨基抗砒 2，4-双氯石碳酸4-氨基抗砒2,4，6-仨溴-3-羟基-苯磺酸4-氨基抗砒 3，5-双氯石碳酸磺酸4-氨基抗砒3，5-双氯-2-羟基-苯磺酸 4-氨基抗砒N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐 4-氨基抗砒仨溴羥基苯甲酸4-氨基抗砒双甲基苯胺4-氨基抗砒N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺 4-氨基抗砒2，2，-AZINO-双(3-乙基苯噻哗-6-磺酸) 4-氨基抗砒4-羥基-3-甲氧基苯甲酸4-氨基抗砒 3-甲基-乙基-羥基苯胺。
全文摘要
本发明涉及一种利用酶循环扩增法、酶比色法及酶联法技术的5′核苷酸酶诊断试剂盒，同时本发明还涉及测定5′核苷酸酶活性浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括缓冲液、还原型辅酶、腺苷单磷酸、丙酮酸、腺苷脱氨酶、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶、过氧化物酶、还原型色原体组合、稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，最终将无色的还原型色原体组合氧化成有色的染料，从而可以通过可见光分析仪器，在400-700nm波长处，测定染料含量的高低，从而测算出5′核苷酸酶的活性浓度大小。
文档编号G01N21/77GK101169376SQ20061009725
公开日2008年4月30日 申请日期2006年10月26日 优先权日2006年10月26日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司