专利名称：5′核苷酸酶诊断试剂盒及5′核苷酸酶活性浓度测定方法
技术领域：
本发明涉及一种5'核苷酸酶诊断试剂盒，同时本发明还涉及测定5'核苷 酸酶活性浓度的方法，属于医学检验测定技术领域。
技术背景医学研究表明，5'-核苷酸酶(5NT)增高主要见于阻塞性黄胆，也可见 于肝癌和肝炎。在胆汁淤积并发胆管炎、原发性和继发性胆汁性肝硬化和慢 性肝炎时，5NT升高率高于碱性磷酸酶；肝肿瘤和肝肉芽肿时5NT升高的敏 感性高于碱性磷酸酶。因为5'-核苷酸酶活性无生理性升高，对于诊断婴幼儿 肝病和妊娠性肝功胆汁淤积较碱性磷酸酶不但敏感，而且有特异性。因此测 定5'-核苷酸酶的活性对于疾病的诊断具有重要意义。5'-核苷酸酶的活性测定方法很多，主要有同位素底物法、化学强酸测磷 法(1925年)。据申请人了解，目前国际上普遍采用同位素底物测试法，方法 为5'-核苷酸酶作用于H3-dUMP，终止反应后，通过离子交换层析柱分析结 果，求得5'-核苷酸酶活性。或者利用5'-核苷酸酶作用于单磷酸腺苷后产生 无机磷，再用化学强酸法分析无机磷含量得以计算出5'-核苷酸酶的活性。同位素底物法方法复杂还有同位素污染，而且需要同位素测定仪，因此 难以切实推广应用。无机磷测定法是1925年发明的方法，准确度不好，强酸 污染环境等等，也不适合推广应用。发明内容本发明要解决的技术问题是提出一种利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，连续监测还 原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定5，核苷酸酶活性浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的5'核苷 酸酶诊断试剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行5'核苷酸酶活性浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因 而可以得到切实的推广应用。本发明5'核苷酸酶活性浓度测定方法原理如下核苷单磷酸+水5'核苷酸酶核苷+磷酸根磷酸根+丙酮酸+氧+水丙酮酸氧化酶乙酰磷酸+ 二氧化碳+过氧化氢二氧化碳+酮戊二酸+还原型辅酶异柠檬酸脱氢酶异柠檬酸+辅酶 核苷单磷酸可以是腺苷单磷酸、肌苷单磷酸或尿苷单磷酸这种方法应用5，核苷酸酶(5'Nudeotidase; EC3丄3.5)酶(偶)联丙酮酸氧 化酶(pyruvate oxidase; EC 1.2.3.3)、异拧檬酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenase; EC1丄1.41; EC1丄1.42)酶促反应连续监测法。5'核苷酸酶酶解核苷单磷酸 反应产生磷酸根，再通过(偶)联合丙酮酸氧化酶、异柠檬酸脱氢酶的作用， 最终将还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成为辅酶(在340nm处没有 吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的速度，通过测量 340nm处吸光度下降的速度，可以测算5'核苷酸酶的活性浓度大小。实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无 论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明5'核苷酸酶诊断试剂较为 理想缓冲液 100mmol/L 稳定剂 500 mmol/L还原型辅酶 0.25 mmol/L丙酮酸氧化酶 10000 U/L异柠檬酸脱氢酶 10000 U/L核苷单磷酸 9 mmol/L丙酮酸 8 mmol/L酮戊二酸 9 mmol/L 本发明的5'核苷酸酶诊断试剂盒可以是单剂，包括缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、丙酮酸氧化酶、异柠檬酸脱氢酶、核 苷单磷酸、丙酮酸、酮戊二酸。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试 剂，直接使用。也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂试剂1缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、核苷单磷酸、丙酮酸、酮戊二酸。试剂2缓冲液、稳定剂、丙酮酸氧化酶、异柠檬酸脱氢酶。 还原型辅酶、丙酮酸氧化酶、异柠檬酸脱氢酶、核苷单磷酸、丙酮酸、酮 戊二酸在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使 用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。 还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂 试剂l缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、核苷单磷酸、丙酮酸、酮戊二酸。 试剂2缓冲液、稳定剂、异柠檬酸脱氢酶。 试剂3缓冲液、稳定剂、丙酮酸氧化酶。 还原型辅酶、丙酮酸氧化酶、异柠檬酸脱氢酶、核苷单磷酸、丙酮酸、酮戊二酸在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态， 在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定5'核苷酸酶活性浓度的方法，其 还原型辅酶可以是NADPH、 NADH或thio- NADH中的一种。
具体实施方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。 实施例一本实施例的5'核苷酸酶诊断试剂为单试剂，包括三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 500 mmol/L还原型辅酶 0.25mmol/L 丙酮酸氧化酶 10000 U/L异柠檬酸脱氢酶 10000 U/L核苷单磷酸 9 mmol/L丙酮酸 8 mmol/L酮戊二酸 9 mmol/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前， 加入纯净水，复溶后使用。在全自动生化分析仪上设定温度37'C，反应时间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测5'核苷酸酶样品与试 剂的体积比例为1/25，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约l分钟 左右，检测时间2分钟左右，理论K值一4180。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪 下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出5'核苷酸酶的活性浓 度大小。 实施例二本实施例的5'核苷酸酶诊断试剂为双试剂，包括试剂1三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 稳定剂 还原型辅酶 核苷单磷酸 丙酮酸 酮戊二酸试剂2三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 稳定剂丙酮酸氧化酶 异柠檬酸脱氢酶试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37"C，反应时间10分钟，起始吸光度 1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测5'核苷酸酶样品与试層mmol/L 50 mmol/L 0.25 mmol/L 9 mmol/L8 mmol/L9 mmol/L100 mmol/L 500 mmol/L10000 U/L10000U/L剂1、试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时 间大约l分钟左右，检测时间2分钟左右，理论K值一2170。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪 下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出5'核苷酸酶的活性浓 度大小。 实施例三本实施例的5，核苷酸酶诊断试剂为三试剂，包括 试剂1三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 稳定剂 还原型辅酶 核苷单磷酸 丙酮酸 酮戊二酸 试剂2三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 稳定剂异柠檬酸脱氢酶 试剂3三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 稳定剂丙酮酸氧化酶 试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体」10Ommol/L 50 mmol/L 0.25画ol/L 9 mmol/L8 mmol/L9 mmol/L100 mmol/L 500 mmol/L 10000 U/L100mmol/L 500 mmol/L 10000U/L:试剂，可以直接使用,测定5，核苷酸酶活性浓度时，在全自动生化分析仪上设定温度37'C，反 应时间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm， 被测5'核苷酸酶样品与试剂1、试剂2、试剂3的体积比例为4/40/5/5，反应 方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右， 理论K值一2170。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪 下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出5，核苷酸酶的活性浓 度大小。申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他测定方法均能达 到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例举。总之，实验证明采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪 器得出所需的测定结果——空白试剂吸光度变化(AA7min)《0.0005;吸光 度时间反应曲线应呈直线下降；试剂可测有效(R》0.99)线形范围可达 500U/L;试剂测试的不准确度，其相对偏差不超过±5%;试剂测试的精密度 (重复性)的变异系数(CV)《2%;试剂在2—8。C下保存，活性可以稳定 一年；——本发明灵敏度高、精确度好，线形范围宽广，稳定期长，足以便 于推广应用。
权利要求
1.一种利用酶比色法及酶联法技术的5’核苷酸酶活性浓度测定方法，其方法原理如下核苷单磷酸+水 5核苷酸酶 核苷+磷酸根磷酸根+丙酮酸+氧+水丙酮酸氧化酶 乙酰磷酸+二氧化碳 +过氧化氢二氧化碳+酮戊二酸+还原型辅酶 异柠檬酸脱氢酶 异柠檬酸+辅酶核苷单磷酸可以是腺苷单磷酸、肌苷单磷酸或尿苷单磷酸将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，测算出5’核苷酸酶的活性浓度大小结果。
2. —种5'核苷酸酶诊断试剂盒，主要成分包括缓冲液20-——500 mmol/L稳定剂l一—4000 mmol/L还原型辅酶O.l———0.35 mmol/L丙酮酸氧化酶1000———80000 U/L异柠檬酸脱氢酶1000——-80000 U/L核苷单磷酸卜50 mmol/L丙酮酸l-50 mmol/L酮戊二酸l一50 mmol/L试剂成分的浓度不一定只限于上述范围；在此范围内效果较好，在此范 围外，试剂仍会反应作用。其特征在于试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也 可以配制成液体试剂，直接使用。
3. 根据权利要求2所述5'核苷酸酶诊断试剂盒，其特征在于 由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、丙酮酸氧化酶、异柠檬酸脱氢酶、核苷 单磷酸、丙酮酸、酮戊二酸组成单剂试剂。
4. 根据权利要求2所述5'核苷酸酶诊断试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、丙酮酸氧化酶、异柠檬酸脱氢酶、核苷 单磷酸、丙酮酸、酮戊二酸组成双剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、 还原型辅酶、核苷单磷酸、丙酮酸、酮戊二酸组成；试剂2，由缓冲液、 稳定剂、丙酮酸氧化酶、异柠檬酸脱氢酶组成。还原型辅酶、丙酮酸氧化 酶、异柠檬酸脱氢酶、核苷单磷酸、丙酮酸、酮戊二酸在试剂1或试剂2 中的位置可以不限。
5. 根据权利要求2所述5'核苷酸酶诊断试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、丙酮酸氧化酶、异柠檬酸脱氢酶、核苷 单磷酸、丙酮酸、酮戊二酸组成多剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、 还原型辅酶、核苷单磷酸、丙酮酸、酮戊二酸组成；试剂2，由缓冲液、 稳定剂、异柠檬酸脱氢酶组成；试剂3，由缓冲液、稳定剂、丙酮酸氧化 酶组成。还原型辅酶、丙酮酸氧化酶、异拧檬酸脱氢酶、核苷单磷酸、丙 酮酸、酮戊二酸在试剂l、试剂2或试剂3中的位置可以不限。
6. 根据权利要求2所述5'核苷酸酶诊断试剂盒，其特征在于还包括稳定剂 1-4000 mmol/L或0.1 %-100%体积比。所述稳定剂为硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。
全文摘要
本发明涉及一种利用酶比色法及酶联法技术的5′核苷酸酶诊断试剂盒，同时本发明还涉及测定5′核苷酸酶活性浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括缓冲液、还原型辅酶、核苷单磷酸、丙酮酸、酮戊二酸、丙酮酸氧化酶、异柠檬酸脱氢酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度下降的速度，从而测算出5′核苷酸酶的活性浓度大小。
文档编号G01N21/31GK101609006SQ200810122819
公开日2009年12月23日 申请日期2008年6月19日 优先权日2008年6月19日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司