专利名称：5＇核苷酸酶诊断试剂盒及5＇核苷酸酶活性浓度测定方法
技术领域：
本发明涉及一种5'核苷酸酶诊断试剂盒，同时本发明还涉及测 定5'核苷酸酶活性浓度的方法，属于医学检验测定技术领域。
技术背景医学研究表明，5'核苷酸酶(5' NT)增高主要见于阻塞性黄胆， 也可见于肝癌和肝炎。在胆汁淤积并发胆管炎、原发性和继发性胆汁 性肝硬化和慢性肝炎时，5' NT升高率高于碱性磷酸酶；肝肿瘤和肝 肉芽肿时5' NT升高的敏感性高于碱性磷酸酶。因为5'-核苷酸酶活 性无生理性升高，对于诊断婴幼儿肝病和妊娠性肝功胆汁淤积较碱性 磷酸酶不但敏感，而且有特异性。因此测定5'-核苷酸酶的活性对于 疾病的诊断具有重要意义。
5'-核苷酸酶的活性测定方法很多，主要有同位素底物法、化学 强酸测磷法(1925年)。据申请人了解，目前国际上普遍采用同位素 底物测试法，方法为5'-核苷酸酶作用于H3-dUMP，终止反应后，通 过离子交换层析柱分析结果，求得5'-核苷酸酶活性。或者利用5' -核苷酸酶作用于单磷酸腺苷后产生无机磷，再用化学强酸法分析无机 磷含量得以计算出5'-核苷酸酶的活性。
同位素底物法方法复杂还有同位素污染，而且需要同位素测定仪， 因此难以切实推广应用。无机磷测定法是1925年发明的方法，准确度 不好，强酸污染环境等等，也不适合推广应用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提出一种利用、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，连续 监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化， 得以测定5'核苷酸酶活性浓度的方法，同时，本发明还将给出用以 实现该方法的5'核苷酸酶诊断试剂盒，采用该试剂盒不仅可以在紫 外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行5'核苷酸酶活性浓 度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。 本发明5'核苷酸酶活性浓度测定方法原理如下
腺苷单磷酸+水5'核苷酸酶腺苷+磷酸根 腺苷+水腺苷脱氨酶肌苷+氨离子 氨离子+丙酮酸+还原型辅酶丙氨酸脱氢酶 L-丙氨酸
+水+辅酶
这种方法应用5'核苷酸酶(偶)联腺苷脱氨酶(EC 3.5.4.4)及丙氨酸脱 氢酶(EC 1.4丄1)酶促反应连续监测法。5'核苷酸酶解腺苷单磷酸 反应产生腺苷，再通过(偶)联合腺苷脱氨酶及丙氨酸脱氢酶的作用， 最终将还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成为氧化型辅酶(在 340nm处没有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度 下降的速度，通过测量340nm处吸光度下降的速度，可以测算5'核 苷酸酶的活性浓度大小。
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合 考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明5'核苷 酸酶诊断试剂盒较为理想缓冲液 100mmol/L 稳定剂 50 mmol/L
还原型辅酶 0.25 mmol/L
腺苷脱氨酶 6000 U/L
丙氨酸脱氢酶 12000 U/L
腺苷单磷酸 6 mmol/L
丙酮酸 16 mmol/L
本发明的5'核苷酸酶诊断试剂盒可以是单剂，包括
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、腺苷单磷酸、丙酮酸、腺苷脱氨酶、
丙氨酸脱氢酶
试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成 液体试剂，直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂 试剂1
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、腺苷单磷酸、丙酮酸。 试剂2
缓冲液、稳定剂、腺苷脱氨酶、丙氨酸脱氢酶。 还原型辅酶、腺苷单磷酸、丙酮酸、腺苷脱氨酶、丙氨酸脱氢酶在 试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用 前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。 也可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂 试剂l
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶。
试剂2
缓冲液、稳定剂、腺苷单磷酸、丙酮酸。 试剂3
缓冲液、稳定剂、腺苷脱氨酶、丙氨酸脱氢酶。 还原型辅酶、腺苷单磷酸、丙酮酸、腺苷脱氨酶、丙氨酸脱氢酶在 试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态， 在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定5'核苷酸酶活性浓度的 方法，其还原型可以是NADPH、 NADH或thio-NADH中的一种。
具体实施例方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。 实施例一
本实施例的5'核苷酸酶诊断试剂为单试剂，包括
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 50 mmol/L
还原型辅酶 0.25 mmol/L
腺苷脱氨酶 6000 U/L
丙氨酸脱氢酶 12000 U/L
腺苷单磷酸 6 mmol/L
丙酮酸 16mmol/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂;
使用前，加入纯净水，复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定温度37'C，反应时间IO分钟， 起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被 测5'核苷酸酶样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为负反应 (下降反应)，延迟时间大约l分钟左右，检测时间2分钟左右，理 论K值—4180。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生 化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出5' 核苷酸酶的活性浓度大小。 实施例二
本实施例的5'核苷酸酶诊断试剂为双试剂，包括
试剂1
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 10Ommol/L
稳定剂
还原型辅酶
腺苷单磷酸
丙酮酸
50 mmol/L
0.25 mmol/L
8 mmol/L
12 mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂
腺苷脱氨酶
丙氨酸脱氢酶
50 mmol/L
8000 U/L 10000U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37C，反应时间10分钟，起始 吸光度1.8士0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测5'核 苷酸酶样品与试剂1、试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为负反应 (下降反应)，延迟时间大约l分钟左右，检测时间2分钟左右，理论 K值-2170。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化 分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出5'核 苷酸酶的活性浓度大小。 实施例三
本实施例的5'核苷酸酶诊断/测定试剂为三试剂，包括-
试剂1
缓冲液
稳定剂
还原型辅酶 试剂2
缓冲液
稳定剂
腺苷单磷酸
丙酮酸 试剂3
缓冲液
100 mmol/L 50 mmol/L 0.25 mmol/L
100 mmol/L 50 mmol/L 4 mmol/L
20 mmol/L
100 mmol/L
稳定剂 50 mmol/L
腺苷脱氨酶 4000 U/L
丙氨酸脱氢酶 20000 U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。 测定5'核苷酸酶活性浓度时，在全自动生化分析仪上设定温度 37°C，反应时间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm， 测试副波长405nm，被测5'核苷酸酶样品与试剂l、试剂2、试剂3 的体积比例为4/40/5/5，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大 约1分钟左右，检测时间2分钟左右，理论K值一2170。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化 分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出5'核 苷酸酶的活性浓度大小。
.总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分 析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好、不受内外源 物质的污染，便于推广应用。
权利要求
1.一种5′核苷酸酶活性浓度测定方法，其方法原理如下id="icf0001" file="A2006100972560002C1.gif" wi="144" he="37" top= "38" left = "26" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="no"/>将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，测算出5′核苷酸酶的活性浓度大小测定结果。
2. —种5'核苷酸酶诊断试剂盒，主要成分包括缓冲液 20——500 mmol/L稳定剂 1——50mmol/L还原型辅酶 0.1——0.35 mmol/L腺苷脱氨酵 2000——50000 U/L丙氨酸脱氢酶 2000——50000 U/L 腺苷单磷酸 l——20 mmol/L丙酮酸 1——60mmol/L其特征在于试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用； 也可以配制成液体试剂，直接使用。
3.根据权利要求2所述5'核苷酸酶诊断试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、腺苷单磷酸、丙酮酸、腺苷脱氨酶(EC 3.5.4.4)、丙氨酸脱氢酶(EC1.4丄1)组成单剂试剂。
4. 根据权利要求2所述5'核苷酸酶诊断试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、腺苷单磷酸、丙酮酸、腺苷脱氨酶(EC3.5.4.4)、丙氨酸脱氢酶(EC1.4丄1)组成双剂试剂；试剂 1，由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、腺苷单磷酸、丙酮酸组成； 试剂2，由缓冲液、稳定剂、腺苷脱氨酶(EC 3.5.4.4)、丙氨酸脱 氢酶(EC 1.4丄1)组成。腺苷单磷酸、丙酮酸、腺苷脱氨酶、丙 氨酸脱氢酶在试剂1或试剂2中的位置可以不限。
5. 根据权利要求2所述5'核苷酸酶诊断试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、腺苷单磷酸、丙酮酸、腺苷脱氨 酶(EC3.5.4.4)、丙氨酸脱氢酶(EC1.4丄1)组成多剂试剂；试剂 1，由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶组成；试剂2,由缓冲液、稳 定剂、腺苷单磷酸、丙酮酸组成；试剂3，由缓冲液、稳定剂、腺 苷脱氨酶、丙氨酸脱氢酶组成。腺苷单磷酸、丙酮酸、腺苷脱氨酶、 丙氨酸脱氢酶在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。
6. 根据权利要求2所述5'核苷酸酶诊断试剂盒，其特征在于还包 括稳定剂1~4000 mmol/L或0.1%-100%体积比。所述稳定剂为 硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethyleneglycol)及防腐剂中的至少一种。
全文摘要
本发明涉及一种利用酶比色法及酶联法技术的5′核苷酸酶诊断试剂盒，同时本发明还涉及测定5′核苷酸酶活性浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括缓冲液、腺苷单磷酸、丙酮酸、腺苷脱氨酶、丙氨酸脱氢酶、还原型辅酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度下降的速度，从而测算出5′核苷酸酶的活性浓度大小。采用本发明完全可以通过紫外/可见光分析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，不受内外源物质的污染，便于推广应用。
文档编号G01N21/78GK101169378SQ20061009725
公开日2008年4月30日 申请日期2006年10月26日 优先权日2006年10月26日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司