专利名称：砷诊断/测定试剂盒及砷浓度测定方法
技术领域：
本发明涉及一种砷诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定砷浓度 的方法，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。
背景技术：
砷普遍存在，特别在自然界的开放水域，海洋食品中含有相当高的砷，
高达200mg/kg。典型的欧洲餐食每日砷摄入通常为10mg。砷很快各自经 肠道和肺完全吸收。有毒砷化合物包括砷(三氧化砷)和无色气体砷都非 常毒，具有大蒜臭味，毒性剂量5 50mg之间，致命剂量〉50mg。大部分 情况下砷从血液到尿液以代谢形式排除，小部分在各组织与巯基团反应， 抑制SH-依赖性酶和物质。
检测方法有用无火焰氢化物技术原子吸收分光光度法。中子活性分 析是最稳定精确方法，因为它不需预处理样本且检测范围非常低，但不是 一般实验室具备这样的检测能力。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提出一种利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，监测还 原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测 定砷浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的砷诊断/测定 试剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分
析仪上进行砷浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实 的推广应用。
本发明砷浓度测定方法原理如下-
蔗糖+磷酸根蔗糖磷酸化酶/As果糖+葡萄糖-l-磷酸 果糖+还原型辅酶甘露醇2-脱氢酶甘露醇+辅酶
这种方法应用需要砷激活的蔗糖磷酸化酶(Disaccharide phosphorylases ; EC 2.4.1.7)酶(偶)联甘露醇2-脱氢酶(mannitol dehydrogenase ; EC 1.1.1.67 ; EC 1.U.138)酶促反应速率比色法。蔗 糖磷酸化酶酶解蔗糖产生果糖，再通过(偶)联合甘露醇2-脱氢酶的作 用，最终将还原型辅酶(在340nrn处有吸收峰)氧化成为辅酶(在340nm 处没有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的速 度，通过测量340nm处吸光度下降的速度，可以测算砷的浓度大小。
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑， 无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明砷诊断/测定试剂盒 较为理想
磷酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 50 mmol/L
还原型辅酶 0.25 mmol/L
蔗糖 20 mmol/L
蔗糖磷酸化酶 10000 U/L
甘露醇2-脱氢酶 8000 U/L
本发明的砷诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、蔗糖、磷酸根、蔗糖磷酸化酶、甘
露醇2-脱氢酶。
试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液 体试剂，直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂 试剂1
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、蔗糖、磷酸根。 试剂2
缓冲液、稳定剂、蔗糖磷酸化酶、甘露醇2-脱氢酶。 还原型辅酶、蔗糖、磷酸根、蔗糖磷酸化酶、甘露醇2-脱氢酶在试剂 l或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶 解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。 还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂 试剂1
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶。 试剂2
缓冲液、蔗糖、磷酸根。 试剂3
缓冲液、稳定剂、蔗糖磷酸化酶、甘露醇2-脱氢酶。 还原型辅酶、蔗糖、磷酸根、蔗糖磷酸化酶、甘露醇2-脱氢酶在试剂 1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用 前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定砷浓度的方法，其还原型辅
酶可以是NADPH、 NADH或thio-NADH中的一种。
具体实施例方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。 实施例一
本实施例的砷诊断/测定试剂为单试剂，包括-
磷酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 50 mmol/L
还原型辅酶 0.25 mmol/L
蔗糖 20 mmol/L
蔗糖磷酸化酶 10000 U/L
甘露醇2-脱氢酶 8000 U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使 用前，加入纯净水，复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定温度37'C，反应时间10分钟，起始吸 光度1.8士0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测砷样品与试 剂的体积比例为1/25，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约1 分钟左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分 析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出砷的浓度大 小。
实施例二
本实施例的砷诊断/测定试剂为双试剂，包括
试剂l
磷酸缓冲液
稳定剂
还原型辅酶
函mmol/L 50 mmol/L
0.25 mmol/L 10 mmol/L
试剂2
磷酸缓冲液 稳定剂
蔗糖磷酸化酶 甘露醇2-脱氢g
100 mmol/L
50 mmol/L
16000 U/L
12000U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37"C，反应时间10分钟，起始吸
光度1.8土0.7，测试主波长340nm,测试副波长405nm，被测砷样品与试
剂1、试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为负反应(下降反应)，延
迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分
析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出砷的浓度大
实施例三
本实施例的砷诊断/测定试剂为三试剂，包括: 试剂1
磷酸缓冲液
稳定剂
还原型辅酶
100 mmol/L 50 mmol/L 0.25 mmol/L
试剂2
磷酸缓冲液
100 mmol/L
30 mmol/L
试剂3
磷酸缓冲液 稳定剂
蔗糖磷酸化酶 甘露醇2-脱氢酶
100 mmol/L 50 mmol/L 20000 U/L 18000U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。 测定砷浓度时，在全自动生化分析仪上设定温度37。C，反应时间10 分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340證，测试副波长405nm，被 测砷样品与试剂1、试剂2、试剂3的体积比例为4/40/5/5，反应方向为 负反应(下降反应)，延迟时间大约l分钟左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分 析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出砷的浓度大
申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他各种还原型色 原体组合均能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类
同，不另一一例举。
总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析 仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，便于推广应用。
权利要求
1.一种利用酶比色法及酶联法技术的砷浓度测定方法，其方法原理如下id="icf0001" file="A2006100972280002C1.gif" wi="131" he="16" top= "38" left = "37" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="no"/>将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，测算出砷的浓度大小测定结果。
2.-种砷诊断/测定试剂盒，主要成分包括磷酸缓冲液 20-稳定剂 卜还原型辅酶 O.l—500 mmol/L 50 mmol/L10.35 mmol/L -50 mmol/L1000-励0一-80000 U/L -80000 U/L蔗糖磷酸化酶 甘露醇2-脱氢酶其特征在于试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也 可以配制成液体试剂，直接使用。
3. 根据权利要求2所述砷诊断/测定试剂盒，其特征在于 由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、蔗糖、磷酸根、蔗糖磷酸化酶、甘 露醇2-脱氢酶组成单剂试剂。
4. 根据权利要求2所述砷诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、蔗糖、磷酸根、蔗糖磷酸化酶、甘露醇2-脱氢酶组成双剂试剂；试剂l，由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、蔗糖、磷酸根组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、蔗糖磷酸化酶、 甘露醇2-脱氢酶组成。还原型辅酶、蔗糖、磷酸根、蔗糖磷酸化酶、 甘露醇2-脱氢酶在试剂1或试剂2中的位置可以不限。
5. 根据权利要求2所述砷诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、蔗糖、磷酸根、蔗糖磷酸化酶、甘 露醇2-脱氢酶组成多剂试剂；试剂l，由缓冲液、稳定剂、还原型辅 酶组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、蔗糖、磷酸根组成；试剂3，由 缓冲液、稳定剂、蔗糖磷酸化酶、甘露醇2-脱氢酶组成。还原型辅酶、 蔗糖、磷酸根、蔗糖磷酸化酶、甘露醇2-脱氢酶在试剂l、试剂2或 试剂3中的位置可以不限。
6. 根据权利要求2所述砷诊断/测定试剂盒，其特征在于还包括稳定 剂1000 mmol/L或0.1%-100%体积比。所述稳定剂为硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、 乙二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。
全文摘要
本发明涉及一种利用酶比色法及酶联法技术的砷诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定砷浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括缓冲液、还原型辅酶、蔗糖、磷酸根、蔗糖磷酸化酶、甘露醇2-脱氢酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度下降的速度，从而测算出砷的浓度大小。采用本发明完全可以通过紫外/可见光分析仪器得出所需的测定结果。
文档编号G01N33/84GK101169446SQ200610097228
公开日2008年4月30日 申请日期2006年10月24日 优先权日2006年10月24日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司