专利名称：：一种高效液相色谱法测定维生素a含量的方法
技术领域：
：本发明属分析化学领域，涉及定量测定制剂中维生素A含量的方法，特别涉及一种用高效液相色谱法测定维生素A含量的相关技术。
背景技术：
：制剂中维生素A的含量测定方法常为紫外-可见分光光度法，中国药典2005版对其有详细的描述，该方法操作比较烦琐，且有适用范围，对某些制剂中的维生素A的含量还不能进行测定(干扰较大，方法不专一)。现公开的反相高效液相色谱法(流动相系甲醇水为90-100:10-0)测定一些含维生素A的复方维生素固体制剂中的维生素A的含量测定时，专属性差，维生素A的峰与其他的杂质峰分离度只能达到1.4以下，难以达到中国药典的要求(分离度应大于1.5)。
发明内容本发明旨在解决含维生素A的固体制剂，尤其是多维元素(例如多维元素片(21))中的维生素A的含量测定问题，这些制剂中的维生素A的含量测定无法使用中国药典所规定的测定方法。-具体方法技术方案如下一种高效液相色谱法测定维生素A含量的方法,其色谱条件为a、填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶；b、流动相为混合比例为80-90:20-10(但不包括90:10)的甲醇和水混合溶液；c、紫外检测器的检测波长为325nm。更进一步，该高效液相色谱法测定维生素A含量的方法，其色谱条件为其所用流动相流速为lml/min，进样体积为20y1。本发明技术进步在于，方法简单，又能达到中国药典的要求。本发明方法的建立过程1、仪器与试剂仪器Waters2487检测器，Waters1525泵，Breez色谱工作站，岛津SPA-10Avp检测器，LC-10ATvp泵，CLASS-VP色谱工作站试剂甲醇(色谱纯)水(注射用)2、含量测定方法的建立2、l波长的选择维生素A紫外光吸收具有自身的特性。我们测定了它的异丙醇溶液在紫外下的吸收图谱，维生素A的检测波长选用325nm。2、2溶解性试验我们将维生素A对照品在溶剂正己垸和二甲亚砜中的溶解性对比试验，结果为维生素A均在正己垸中易溶，而在二甲亚砜中溶解，表明维生素A在正己垸中的溶解性能优于二甲亚砜。2、3溶剂的干扰性试验我们将维生素A含量测定中的提取前的二甲亚砜上清液及用正己烷提取浓縮加异丙醇溶解后的测试溶液进行测试比较，以此来选择所需的溶剂。方法如下取制剂，精密称定，研细，精密称取适量(约相当于维生素A7500IU)，置50ml量瓶中，加二甲亚砜20ml，在50'C超声助溶20分钟，取出，冷至室温，离心分离10分钟OOOO转/分)。取上清液lml作供试品溶液(1);另精密移取上清液15ml，置50ml比色管中，加入正己烷20ml，静置使分层，用长胶头滴管吸取正己垸层至100ml量瓶中，再分别用20ml提取三次，合并提取液，加正己烷至刻度，混匀。取2ml，氮气流下吹干，加入异丙醇25ml，充分溶解，混匀，作为测定维生素A供试品溶液(2)。分别在各自的色谱条件下，取供试品溶液(1)和(2)各20wl，注入色谱仪，记录色谱图。结果显示直接将提取前的二甲亚砜上清液进样时，对维生素A的含量测定干扰较用正己垸提取浓縮加异丙醇溶解后的测试溶液要大(而且对色谱柱伤害较大试验证明将此溶液连续进样二十几针后，柱效明显降低)。因此，我们采用对二甲亚砜上清液先用正己烷提取浓縮再加异丙醇溶解后再作为含量测定的供试品溶液。2、4提取程度试验取正己垸提取前的二甲亚砜样品溶液和提取后的二甲亚砜样品溶液，在维生素A各自含量测定HPLC法条件下分别测定。结果显示提取后的二甲亚砜样品溶液的色谱图中，已看不到维生素A主峰，表明正己烷能对二甲亚砜样品溶液中的维生素A提取完全。2、5方法的专属性破坏性(酸、碱、双氧水、热、光破坏)试验下的分离取本含量测定所需的供试品的量置于酸(0.lmol/mlHC1)、碱(0.lmol/mlNaOH)、双氧水(10%)、热60。C、光(4000UiX)的条件下破坏2小时(由于这些组分都是脂溶性的维生素，本身对空气、热、光也比较敏感。在操作的过程中就会发生降解)。结果表明本制剂在这些条件下均有降解峰产生，且它们与主峰、主峰与主峰之间均能达到良好的分离。各成分色谱峰之间及它们与杂质色谱峰的分离也均良好，因此我们认为各自的含量测定方法具有良好的专属性。2、6与中国药典的方法的比较由于药典方法为紫外-可见分光光度法。该方法对某些含维生素A制剂的含量测定专属性差，干扰大。本方法解决了紫外-可见分光光度法存在的缺点。2、7进样精密度:取维生素A含量测定项下对照品溶液，精密吸取20W进样，重复6次，记录各主峰面积，计算该方法进样精密度。试验结果见下表:<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>由结果可见，维生素A的相对标准偏差均小于1.5免，表明本方法的进样精密度良好。2、8回收率试验(加空白辅料)供试品溶液精密称取空白辅料适量(约相当于制剂含维生素A7500IU)，9份，置于200ml的棕色容量瓶中，再相应精密加入维生素A对照品母液(浓度约为180Pg/ral)5、10、18ml，用异丙醇溶解定容。在50'C超声助溶20分钟，取出，过滤，冷至室温备用。对照品溶液精密加入维生素A对照品母液(每lml约含维生素A为180l^g的异丙醇溶液)10.0ml,置于200ml的棕色容量瓶中，用异丙醇溶解定容，摇匀备用。照上述维生素A各自含量测定HPLC法测定。计算，<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>以上结果表明本发明的回收率(加空白辅料)良好。2、9回收率试验(不加空白辅料)供试品溶液精密量取维生素A对照品母液(每lml约含维生素A为180Pg的异丙醇溶液)5.0、10.0、18.0ml，置于200ml的棕色容量瓶中，用异丙醇溶解定容。对照品溶液精密量取维生素A对照品母液(每lml约含维生素A为180Pg的异丙醇溶液)10.0ml,置于200ral的棕色容量瓶中，用异丙醇溶解定容。照上述维生素A各自含量测定HPLC法测定。计算，结果见下表<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>以上结果表明本发明的回收率(不加空白辅料)良好。2、10线性及范围取维生素A对照品适量，用异丙醇配制浓度各异的系列溶液，分别取20W进样，记录主峰面积。计算浓度与峰面积之间的线性关系，得回归曲线与回归方程。维生素A的回归曲线<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>从维生素A线性方程(Y=6785.9X-1682.5，r=0.9992)中可以看出，在浓度36.72~68.85Pg/ml范围内，维生素A的色谱峰面积与浓度之间有良好的线性关系。2、11检测限及定量限将对照品溶液逐级稀释，注入色谱仪，记录峰高，当峰高为基线噪声的10倍高时的浓度为定量限浓度为226ng/ml，23倍高时的浓度为检测限浓度为75ng/ml。2、12方法耐用性在本品的方法学研究及含量测定中，我们曾使用过不同的液相仪及不同品牌的色谱柱，其结果均为一致。因此表明本方法的耐用性能达到要求。2、13测试溶液的稳定性取本品的含量测定的测试溶液，放置，分别于不同时间进样，记取主峰面积，视其稳定性。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>上表结果表明本品的含量测定的测试溶液在8时内维生素A的峰面积未见明显变化。2、14重复性试验精密称取含维生素A制剂细粉适量(约相当于制剂含维生素A7500IU)6份，依照含量测定项下的方法测定含量，结果见下表-序号123456含量(%)100.65101.6797.2998.2297.4897.64平均含量(％)98.83RSD(%)1.89结果表明维生素A的重复性试验RSD小于2.0%。通过上述方法的建立过程，本法测定含维生素A制剂中的维生素A的含量能达到真实、准确的分析要求。具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步的描述，但是本发明的保护范围并不限于实施例。按以下检测方法对四批多维元素片(21)中的维生素A进行含量检测。实施例一照高效液相色谱法(中国药典2005年版二部附录VA)测定，避光操作。维生素A用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇-水(85:15)为流动相，检测波长为325nm，流速1.Oml/min，理论板数按维生素A峰计算应不小于1000,主峰与杂峰的分离度应符合要求。维生素A对照品溶液的制备取维生素A醋酸酯对照品适量，精密称定，用异丙醇配制成浓度为每lml中约含维生素A醋酸酯9ug的溶液，摇匀。供试品溶液的制备取本品30片，精密称定，研细，精密称取适量(约相当于制剂含维生素A7500IU)，置50ml量瓶中，加二甲亚砜20ml，在5(TC超声助溶20分钟，取出，冷至室温，离心分离10分钟(3000转/分)。精密移取上清液15ml，置50ml比色管中，加入正己烷20ml，小心振摇提取，静置使分层，用长胶头滴管吸取正己垸层至100ml量瓶中，再用正己烷20ml提取三次，合并提取液，加正己烷至刻度，混匀。取2ml，氮气流下吹干，加入异丙醇25ml，充分溶解，摇匀，即得。测定法在本发明的色谱条件下，取对照品溶液和供试品溶液各20ul，注入色谱仪，记录色谱图，以外标法计算维生素A的含量。主峰保留时间约为20分钟，杂质峰的相对保留时间约为0.85。结果见下表:批号T03G117T03G118T03G119T03G120含量(%)99.3599.6299,1099.05实施例二照高效液相色谱法(中国药典2005年版二部附录VA)测定，避光操作。维生素A用十八垸基硅垸键合硅胶为填充剂，以甲醇-水(80:20)为流动相，检测波长为325nm，流速1.Oml/min，理论板数按维生素A峰计算应不小于1000，主峰与杂峰的分离度应符合要求。维生素A对照品溶液的制备取维生素A醋酸酯对照品适量，精密称定，用异丙醇配制成浓度为每lral中约含维生素A醋酸酯9ixg的溶液，摇匀。供试品溶液的制备取本品30片，精密称定，研细，精密称取适量(约相当于制剂含维生素A7500IU)，置50ml量瓶中，加二甲亚砜20ml，在50。C超声助溶20分钟，取出，冷至室温，离心分离10分钟(3000转/分)。精密移取上清液15ml，置50ml比色管中，加入正己垸20ml，小心振摇提取，静置使分层，用长胶头滴管吸取正己垸层至100ml量瓶中，再用正己垸20ral提取三次，合并提取液，加正己烷至刻度，混匀。取2ml，氮气流下吹干，加入异丙醇25ml，充分溶解，摇匀，即得。测定法在本发明的色谱条件下，取对照品溶液和供试品溶液各20n1，注入色谱仪，记录色谱图，以外标法计算维生素A的含量。主峰保留时间约为25分钟，杂质峰的相对保留时间约为0.80。结果见下表:<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>实施例三照高效液相色谱法(中国药典2005年版二部附录VA)测定，避光操作。维生素A用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇-水(89:11)为流动相，检测波长为325nm，流速1.Oml/min，理论板数按维生素A峰计算应不小于1000，主峰与杂峰的分离度应符合要求。维生素A对照品溶液的制备取维生素A醋酸酯对照品适量，精密称定，用异丙醇配制成浓度为每lml中约含维生素A醋酸酯9txg的溶液，摇匀。供试品溶液的制备取本品30片，精密称定，研细，精密称取适量(约相当于制剂含维生素A7500IU)，置50ml量瓶中，加二甲亚砜20ml，在50'C超声助溶20分钟，取出，冷至室温，离心分离10分钟(3000转/分)。精密移取上清液15ml，置50ml比色管中，加入正己垸20ml，小心振摇提取，静置使分层，用长胶头滴管吸取正己垸层至100ml量瓶中，再用正己垸20ml提取三次，合并提取液，加正己烷至刻度，混匀。取2ml，氮气流下吹干，加入异丙醇25ml，充分溶解，摇匀，即得。测定法在本发明的色谱条件下，取对照品溶液和供试品溶液各20ul，注入色谱仪，记录色谱图，以外标法计算维生素A的含量。主峰保留时间约为14分钟，杂质峰的相对保留时间约为0.90。结果见下表:<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>比较例一照高效液相色谱法(中国药典2005年版二部附录VA)测定，避光操作。维生素A用十八烷基硅垸键合硅胶为填充剂，以甲醇-水(96:4)为流动相(已公开的比例)，检测波长为325nm,流速1.Oral/min，理论板数按维生素A峰计算应不小于1000，主峰与杂峰的分离度应符合要求。维生素A对照品溶液的制备取维生素A醋酸酯对照品适量，精密称定，用异丙醇配制成浓度为每lml中约含维生素A醋酸酯9wg的溶液，摇匀。供试品溶液的制备取本品30片，精密称定，研细，精密称取适量(约相当于制剂含维生素A7500IU)，置50ml量瓶中，加二甲亚砜20ml，在5(TC超声助溶20分钟，取出，冷至室温，离心分离10分钟(3000转/分)。精密移取上清液15ml，置50ml比色管中，加入正己垸20ml，小心振摇提取，静置使分层，用长胶头滴管吸取正己垸层至100ml量瓶中，再用正己烷20ml提取三次，合并提取液，加正己烷至刻度，混匀。取2ml,氮气流下吹干，加入异丙醇25ml，充分溶解，摇匀，即得。测定法在本发明的色谱条件下，取对照品溶液和供试品溶液各20u1，注入色谱仪，记录色谱图，以外标法计算维生素A的含量。结果维生素A的峰与其他的杂质峰分离度只能达到1.4以下，未达到中国药典的要求(分离度应大于1.5)。因此无法得出正确的含量结果。比较例二照高效液相色谱法(中国药典2005年版二部附录VA)测定，避光操作。维生素A用十八垸基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇-水(90:10)为流动相，检测波长为325nm，流速1.0ml/min，理论板数按维生素A峰计算应不小于1000,主峰与杂峰的分离度应符合要求。维生素A对照品溶液的制备取维生素A醋酸酯对照品适量，精密称定，用异丙醇配制成浓度为每lml中约含维生素A醋酸酯9jxg的溶液，摇匀。供试品溶液的制备取本品30片，精密称定，研细，精密称取适量(约相当于制剂含维生素A7500工U)，置50ml量瓶中，加二甲亚砜20ml，在50。C超声助溶20分钟，取出，冷至室温，离心分离10分钟(3000转/分)。精密移取上清液15ral，置50ml比色管中，加入正己烷20ml，小心振摇提取，静置使分层，用长胶头滴管吸取正己垸层至100ml量瓶中，再用正己垸20ml提取三次，合并提取液，加正己烷至刻度，混匀。取2ml，氮气流下吹干，加入异丙醇25ml，充分溶解，摇匀，即得。测定法在本发明的色谱条件下，取对照品溶液和供试品溶液各20"1,注入色谱仪，记录色谱图，以外标法计算维生素A的含量。结果主峰保留时间约为12分钟，杂质峰的相对保留时间约为0.93。维生素A的峰与其他的杂质峰分离度只能达到1.45，未达到中国药典的要求(分离度应大于1.5)。因此无法得出正确的含量结果。结论从实施例和比较例的结果可以看出主峰的保留时间随流动相中甲醇比例增大而延长，大于80%时，主峰的保留时间过长，从而使试验时间过长；甲醇和水混合比例为80-90:20-10，(但不包括90:10)，作为色谱流动相，主峰的保留时间的范围合理，维生素A的峰与其他的杂质峰分离度能大于1.5，符合中国药典的要求；甲醇和水混合比例为90:10时，杂质峰的相对保留时间过大(约为0.93)，使维生素A的峰与其他的杂质峰分离度只能达到1.45，不能达到中国药典的要求(分离度应大于1.5);再增大甲醇的比例(大于90%)，维生素A的峰与其他的杂质峰分离度更小，更难达到中国药典的要求。因此本发明显优于己公开的技术，方法简单，又能达到中国药典的要求。因此该方法适用于含维生素A的固体制剂，尤其是多维元素(例如多维元素片(21))中的维生素A的含量测定问题，这些制剂中的维生素A的含量测定无法使用中国药典所规定的测定方法。权利要求1、一种高效液相色谱法测定维生素A含量的方法，其特征在于其色谱条件为a、填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶；b、流动相为混合比例为80-9020-10，但不包括9010的甲醇和水混合溶液；c、紫外检测器的检测波长为325nm。2、根据权利要求1所述的高效液相色谱法测定维生素A含量的方法，其特征在于所用流动相流速为lml/min,进样体积为20n1。全文摘要本发明涉及一种高效液相色谱法测定维生素A含量的方法。本方法的色谱条件为a.所用色谱柱的填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶；b.色谱流动相为混合比例为80-90∶20-10(但不包括90∶10)甲醇和水混合溶液；c.所用紫外检测器的检测波长为325nm。所用流动相的流速为1ml/min，进样体积为20μl。本发明准确、可靠，线性范围36.72～68.85μg/ml，线性相关系数r＝0.9992，回收率100.3％，RSD小于2％。文档编号G01N30/00GK101393177SQ20081012163公开日2009年3月25日申请日期2008年10月13日优先权日2008年10月13日发明者华周,彭忠华,朱杰英,邵雷鸣申请人:杭州民生药业集团有限公司