一种猴头菌片的质量检测方法及其应用
【专利摘要】本发明提供一种猴头菌片的质量检测方法，该方法包括(1)制备混合标准品溶液、(2)制备供试品溶液、(3)色谱条件、(4)绘制标准曲线并回归计算、(5)测定供试品溶液。还提供了根据本发明的质量检测方法所检测得到的猴头菌片剂。本发明的质量检测方法可以有效地全面监控猴头菌片的质量，监控生产工艺的稳定性，从而保障产品的质量稳定、均匀、可控，还可用于鉴定伪造产品，以保证该品种药物的正常生产和流通秩序。
【专利说明】
-种猴头菌片的质量检测方法及其应用
技术领域
[0001] 本发明设及一种药物的检测方法，具体设及一种猴头菌片的质量检测方法及其产 品。
【背景技术】
[0002] 猴头菌片是猴头菌菌丝体水提物制成的片剂，其具有益气补血、扶正培本、养胃护 胃的作用，临床上常用于治疗胃溃瘍、十二指肠溃瘍及慢性胃炎等，对多种消化道疾病均有 较好的疗效。猴头菌片含多糖、多肤类、核巧酸类、氨基酸等成分，具有免疫调节，保护胃肠 道等作用。
[0003] 猴头菌片的现有质量控制方法有分光光度法测定蛋白多糖含量、高效液相色谱法 测定腺巧含量，而没有一种能全面表征猴头菌片质量的方法。还有一些文献提及了使用 HPLC对猴头菌片剂中的腺巧含量进行检测的方法，或者对猴头菌本身的某些成分进行鉴定 和检测的方法等等，但是运些方法也未能全面准确地表征猴头菌药物的质量，其中的一些 方法甚至不能检测到猴头菌通常含有的有效成分，反而不利于产品的质量控制。
[0004] 因此，为了规范猴头菌片的质量标准，解决猴头菌片质量参差不齐的问题，对猴头 菌片的质量控制方法有待于进一步研究和改善。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于克服现有技术中的上述缺陷，提供了一种利用猴头菌片的指纹 图谱从宏观上、整体上较为全面地检测猴头菌片的质量的方法，还提供了该质量检测方法 的应用。
[0006] 猴头菌片的现有质量控制方法为分光光度法测定蛋白多糖的含量和高效液相色 谱法测定腺巧的含量。然而，猴头菌片是W整体为活性物质，因此单靠测定一种或几种有效 成分考查猴头菌片的稳定性是不够的，不能解决其成分复杂、产品批次间质量差异的问题， 而本发明建立的猴头菌片的HPlX指纹图谱的质量控制方法则解决了运些不足。
[0007] 为实现上述目的，本发明提供了一种猴头菌片的质量检测方法，该方法的特点在 于采用了高效液相色谱法，其具体包括W下步骤：
[000引（1)制备混合标准品溶液：
[0009] 精密称取适量胞巧、腺嚷岭、尿巧、腺巧和鸟巧对照品，加水配制成每ImL含胞巧1 ~20yg、腺嚷岭1~20yg、尿巧20~40yg、腺巧20~40yg、鸟巧1~20yg的混合标准品溶液。可 W优选为每1血含胞巧5~化g、腺嚷岭3~化g、尿巧25~35蛇、腺巧25~35蛇、鸟巧2~化邑的 混合标准品溶液。
[0010] (2)制备供试品溶液：
[0011] 取猴头菌片，去包衣，研细，精密称取，置于具塞锥形瓶中，加水，密塞，称定重量， 超声提取，放冷，再称重量，用水补足减失的重量，离屯、，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。 [001^ (3)色谱条件：
[001 ；3] WCi8色谱柱，W甲醇-体积百分比0.08~0.30 % (下文中W % VOI %表示)憐酸水溶 液为流动相进行梯度洗脱，柱溫：21~30°C，紫外检测波长：220~280nm，流速：0.40~ 1.20mL ? min-i，洗脱时间：50~lOOmin。
[0014] (4)绘制标准曲线并回归计算：
[0015] 取所述的混合标准品溶液，分别进样2、5、10、15、20、2扣L，注入高效液相色谱仪， 按照步骤(3)的色谱条件重复进样测定3次，记录色谱峰，W进样量X(iig)为横坐标，峰面积 平均值Y为纵坐标，绘制标准曲线并进行回归计算，分别得到胞巧、腺嚷岭、尿巧、腺巧和鸟 巧的线性关系。
[0016] (5)测定供试品溶液：
[0017] 精密吸取所述供试品溶液注入高效液相色谱仪，按照步骤(3)的色谱条件得到指 纹图谱，记录峰面积，并按照步骤(4)得到的各线性关系计算胞巧、腺嚷岭、尿巧、腺巧和鸟 巧的平均含量。
[0018] 根据本发明的质量检测方法，其中，所述方法还包括：
[0019] (6)按照与步骤（1)~（5)相同的方法测定10批猴头菌片的指纹图谱，然后使用相 似度评价系统对所得10批猴头菌片的指纹图谱进行分析，得到猴头菌片的共有模式图谱， W及运10批猴头菌片的指纹图谱与共有模式图谱的相似度。
[0020] 根据本发明的质量检测方法，其中，所述方法还包括：
[0021] (7)按照与步骤（1)~(5)相同的方法测定任意批次的猴头菌片的胞巧、腺嚷岭、尿 巧、腺巧和鸟巧的含量;和/或
[0022] (8)按照与步骤（1)~（5)相同的方法测定任意批次的猴头菌片的指纹图谱，并使 用相似度评价系统计算其与步骤(6)的共有模式图谱的相似度。
[0023] 根据本发明的质量检测方法，其中，在步骤（1)中，精密称取适量胞巧、腺嚷岭、尿 巧、腺巧和鸟巧对照品，分别加水配制为每ImL含168 .SOiig胞巧、57.50yg腺嚷岭、199.2化g 尿巧、198.0化g腺巧、51.60]ig鸟巧的五份溶液，然后从运五份溶液中分别取适量并混合，加 水配制为每1血含胞巧6.75蛇、腺嚷岭4.60蛇、尿巧31.8化g、腺巧31.6祉g、鸟巧4.13iig的混 合标准品溶液。
[0024] 根据本发明的质量检测方法，其中，所述步骤(2)可W优选为:取猴头菌片10片，去 包衣，研细，精密称取0.25~1.50g，置于具塞锥形瓶中，精密加入20mL水，密塞，称定重量， 超声提取20~60min，放冷，再称重量，用水补足减失的重量，离屯、，滤过，取续滤液，即得供 试品溶液。优选地，精密称取0.5g，超声提取30min。更优选地，400化? mirfi离屯、，0.22WI1滤 膜滤过。
[0025] 根据本发明的质量检测方法，其中，所述步骤(3)可W优选为：WCis色谱柱，W甲 醇-0.1%vol%憐酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，柱溫:26°C，紫外检测波长:260nm，流 速:0.5mL ? min-i，洗脱时间：60min。
[0026] 根据本发明的质量检测方法，其中，步骤(3)中的梯度洗脱条件为:0分钟时，流动 相A为占流动相总体积0 %的甲醇、流动相B为占流动相总体积100 %的0.1 % VOl %憐酸水溶 液;25分钟时，流动相A为占流动相总体积0.2 %的甲醇、流动相B为占流动相总体积99.8% 的0.1 % VOl %憐酸水溶液;30分钟时，流动相A为占流动相总体积0.5%的甲醇、流动相B为 占流动相总体积99.5 %的0.1 % VOl %憐酸水溶液;35分钟时，流动相A为占流动相总体积 3.5 %的甲醇、流动相B为占流动相总体积96.5 %的O. I % VOl %憐酸水溶液;45分钟时，流动 相A为占流动相总体积3.8%的甲醇、流动相B为占流动相总体积96.2%的0.1 % VOl %憐酸 水溶液;60分钟时，流动相A为占流动相总体积4.2 %的甲醇、流动相B为占流动相总体积 95.8%的0.1% VO1%憐酸水溶液。
[0027]梯度洗脱条件具体如下表所示：
[009?1
[0029] 根据本发明的质量检测方法，其中，步骤(4)中的回归计算的结果为:胞巧的回归 方程为Y = 3621.9X+0.6092，r为0.9999，线性范围为0.0 l~0.17iig;腺嚷岭的回归方程为Y =11776X-2.3814，r为0.9999，线性范围为0.0 l~0.1;尿巧的回归方程为Y = 5862.9x+ 5.3668，r为0.9999，线性范围为0.06~0.80yg;腺巧的回归方程为Y = 6191. lx+6.2911，r为 0.9999，线性范围为0.06~0. SOiig;鸟巧的回归方程为Y = 4327.6x+0.7886，r为0.9999，线 性范围为0.01~O.lOyg。
[0030] 该回归计算的结果具体如下表所示：
[0031]
[0032] 根据本发明的质量检测方法，其中，所述共有模式图谱中有16个特征共有峰，其中 2号峰为胞巧、8号峰为腺嚷岭、9号峰为尿巧、12号峰为腺巧、13号峰为鸟巧;优选地，其中9 号峰为参照峰，也是最强色谱峰;更优选地，所述共有模式图谱的总长度为60min，其中单峰 面积超过总峰面积1 %的峰有10个，它们是1~16号峰，单峰面积超过总峰面积5 %的峰有6 个，它们是5号峰、7号峰、8号峰、9号峰、12号峰、15号峰，单峰面积超过总峰面积15 %的有2 个，它们是9号峰和12号峰，单峰面积超过总峰面积25%的有1个，它是9号峰;进一步优选 地，所述16个特征共有峰具体如下，
[0033] 1号峰的平均保留时间RT为10.46min，RSD为0.33 %，峰面积为125.982, RSD为 35.38%;
[0034] 2号峰的平均保留时间RT为12.04min，RSD为0.38 %，峰面积为198.013, RSD为 41.68%;
[0035] 3号峰的平均保留时间RT为12.09min，RSD为0.24 %，峰面积为88.825, RSD为 70.37%;
[0036] 4号峰的平均保留时间RT为12.62min，RSD为0.15%，峰面积为257.720，RSD为 59.50%;
[0037] 5号峰的平均保留时间RT为13.09min，RSD为0.34 %，峰面积为625.366, RSD为 42.44% ；
[003引 6号峰的平均保留时间RT为15.51min，RSD为0.32 %，峰面积为102.070, RSD为 51.89%;
[0039] 7号峰的平均保留时间RT为17.19min，RSD为0.31 %，峰面积为353.710，RSD为 60.76%;
[0040] 8号峰的平均保留时间RT为18.31min，RSD为0.61 %，峰面积为675.391，RSD为 27.70%;
[0041 ] 9号峰的平均保留时间RT为23.26min，RSD为0.39 %，峰面积为1959.539, RSD为 46.88%;
[0042] 10号峰的平均保留时间RT为24.96min，RSD为0.49 %，峰面积为178.417, RSD为 25.76%;
[0043] 11号峰的平均保留时间RT为27.29min，RSD为0.26%，峰面积为141.349，RSD为 27.14%;
[0044] 12号峰的平均保留时间RT为34.36min，RSD为0.50%，峰面积为1170.988，RSD为 26.76%;
[0045] 13号峰的平均保留时间RT为43.95min，RSD为0.37 %，峰面积为282.908，RSD为 87.40%;
[0046] 14号峰的平均保留时间RT为45.09min，RSD为0.40 %，峰面积为194.799, RSD为 64.99%;
[0047] 15号峰的平均保留时间RT为46.49min，RSD为0.41%，峰面积为501.655，RSD为 33.:34%;
[004引 16号峰的平均保留时间RT为48.19min，RSD为0.44%，峰面积为237.035，RSD为 36.89%。
[0049] 本发明还提供了根据本发明的质量检测方法所检测得到的猴头菌片剂。
[0050] 需说明的是，在本发明构思的前提下对色谱条件进行进一步优化或改进的技术方 案均属于本发明的保护内容。
[0051] 本发明的质量检测方法相对于现有技术可W获得如下有益效果：
[0052] 1、本发明的检测方法不仅构建了猴头菌片的指纹图谱技术标准及共有模式图谱， 还能检测猴头菌片中胞巧、腺嚷岭、尿巧、腺巧和鸟巧等有效成分的含量，可W有效地全面 监控猴头菌片的质量，监控生产工艺的稳定性，从而保障产品的质量稳定、均匀、可控。另 夕h该质量检测方法可用于鉴定伪造产品，W保证该品种药物的正常生产和流通秩序。
[0053] 2、在本发明的基础上，可W开展指纹图谱、有效成分与功效活性的相关性研究，从 而有助于阐明内在化学成分的功效作用。
[0054] 3、本发明的方法还具有良好的可行性、稳定性和重现性。
【附图说明】
[0055] W下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
[0056] 图1为本发明实施例1得到的混合标准品溶液(A)和供试品溶液(B)的色谱图；
[0057] 图2为本发明实施例2得到的10批猴头菌片的HPLC图谱和共有模式图谱。其中R为 共有模式图谱。
【具体实施方式】
[0058] 下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，运些实施例仅仅是 用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于W任何形式限制本发明。
[0059] 本部分对本发明试验中所使用到的材料W及试验方法进行一般性的描述。虽然为 实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽 可能详细描述。本领域技术人员清楚，在上下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操 作方法是本领域公知的。
[0060] W下实施例中设及的仪器与试剂为：
[0061 ] 仪器:Agilent 1260高效液相色谱仪(美国Agilent公司）、色谱柱为ZORBAX SB-Aq (5皿,4.6X250mm)柱、CP225D十万分之一电子天平（Sartoiyus公司）、BT214D万分之一电子 天平（Sarto巧US公司KSB25-12DTD超声波清洗器(宁波新芝生物科技有限公司）及锥形瓶、 漏斗、滤纸等。
[0062]试剂：甲醇(色谱纯，美国Tedia公司），水为高纯水，其余试剂均为分析纯。胞巧(批 号100914316,美国SIGMA公司）、腺嚷岭(批号110886-200001，中国药品生物制品检定所）、 尿巧(批号1001157075,中国药品生物制品检定所）、腺巧(批号110879-201202,中国药品生 物制品检定所）、鸟巧(批号106K1848,美国SIGMA公司）。猴头菌片(长春迪瑞制药有限公司， 批号：140401，141001;上海华源安徽仁济制药有限公司，批号：140701，140528;上海雷允上 药业有限公司，140213;湖北襄阳隆中药业集团有限公司，批号：140501，140325;广州白云 山和记黄捕中药有限公司，批号：140325，140408，140522，140528，150322)。
[006；3] 实施例1
[0064] 本实施例用于说明本发明提供的猴头菌片的质量检测方法。
[0065] 采用本发明的质量检测方法对1批猴头菌片的进行如下步骤的检测，可W得到该 批猴头菌片的指纹图谱及其胞巧、腺嚷岭、尿巧、腺巧和鸟巧的含量。
[0066] (1)制备混合标准品溶液：
[0067] 精密称取适量胞巧、腺嚷岭、尿巧、腺巧和鸟巧对照品，分别加水配制为每ImL含 168. SOiig胞巧、57.50yg腺嚷岭、199.20yg尿巧、198. OOiig腺巧、51.60yg鸟巧的五份溶液，然 后从运五份溶液中分别取适量并混合，W得到每ImL含胞巧6.75yg、腺嚷岭4.60yg、尿巧 31.8化g、腺巧31.6祉g、鸟巧4.13iig的混合标准品溶液。
[0068] 基于本发明提供的技术方案，混合标准品溶液中的胞巧、腺嚷岭、尿巧、腺巧和鸟 巧的浓度可W分别在一定范围内选择。合适的范围可W为每ImL含胞巧1~20iig、腺嚷岭1~ 2化g、尿巧20~40]ig、腺巧20~40]ig、鸟巧1~20]ig;可W优选为每1血含胞巧5~化g、腺嚷岭 3~化g、尿巧25~35iig、腺巧25~35iig、鸟巧2~化g。本实施例所采用的浓度仅为优选的实 施方式。
[0069] (2)制备供试品溶液：
[0070] 取猴头菌片（批号：140325,广州白云山和记黄捕中药有限公司HO片，去包衣，研 细，精密称取0.5g，置于50mL具塞锥形瓶中，精密加入20mL水，密塞，称定重量，超声提取 30min，放冷，再称重量，用水补足减失的重量，400化? mirTi离屯、，0.22]im滤膜滤过，取续滤 液，得到供试品溶液。
[0071] 基于本发明提供的技术方案，合适的精密称取的质量范围可W是0.25~1.50g，超 声提取的时间范围可W是20~60min。本实施例所采用的条件仅为优选的实施方式。
[0072] (3)色谱条件：
[0073] 采用的Cis色谱柱为ZORBAX SB-Aq柱(4.6 X 250mm，5皿），W 甲醇-0.1 % VOl % 的憐 酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，柱溫:26°C，紫外检测波长:260nm，流速:0.5mL ? mirTi，洗 脱时间：60min，具体梯度洗脱的条件如下表1:
[0074] 表1梯度洗脱条件
[0076] 梯度洗脱条件也可W表述为：
[0077] 0分钟时，流动相A为流动相总体积0 %的甲醇、流动相B为流动相总体积100 %的 0.1 % VOl %憐酸水溶液；
[0078] 25分钟时，流动相A为流动相总体积0.2 %的甲醇、流动相B为流动相总体积99.8 % 的0.1 % VOl %憐酸水溶液；
[0079] 30分钟时，流动相A为流动相总体积0.5 %的甲醇、流动相B为流动相总体积99.5 % 的0.1 % VOl %憐酸水溶液；
[0080] 35分钟时，流动相A为流动相总体积3.5 %的甲醇、流动相B为流动相总体积96.5 % 的0.1 % VOl %憐酸水溶液；
[0081 ] 45分钟时，流动相A为流动相总体积3.8 %的甲醇、流动相B为流动相总体积96.2 % 的0.1 % VOl %憐酸水溶液；
[0082] 60分钟时，流动相A为流动相总体积4.2 %的甲醇、流动相B为流动相总体积95.8% 的0.1 % VOl %憐酸水溶液。
[0083] 基于本发明提供的技术方案，憐酸水溶液的浓度可W为0.08~0.30%vol%，柱溫 可W为21~30°C，紫外检测波长可W为220~280皿，流速可W为0.40~1.20mL ? min-i，洗脱 时间可W为50~lOOmin。本实施例所采用的条件仅为优选的实施方式。
[0084] (4)绘制标准曲线并回归计算：
[00化]取步骤（1)的混合标准品溶液，分别进样2、5、10、15、20、2化L注入高效液相色谱 仪，按照步骤(3)的色谱条件重复进样测定3次，记录色谱峰(见图1，其中A为混合标准品溶 液的色谱图），W进样量X(iig)为横坐标，峰面积平均值Y为纵坐标，绘制标准曲线并进行回 归计算，从而分别得到胞巧、腺嚷岭、尿巧、腺巧和鸟巧的线性关系。计算结果如下表2: [0086]表2胞巧、腺嚷岭、尿巧、腺巧、鸟巧五种成分的线性关系
[0OR71
[0088] (5)测定供试品溶液：
[0089] 精密吸取步骤(2)的供试品溶液注入高效液相色谱仪，按照步骤(3)的色谱条件得 到指纹图谱(见图1，其中B为供试品溶液的色谱图），记录峰面积，并按照步骤(4)得到的各 线性关系计算胞巧、腺嚷岭、尿巧、腺巧和鸟巧的平均含量。
[0090] 其中的2号峰为胞巧、8号峰为腺嚷岭、9号峰为尿巧、12号峰为腺巧、13号峰为鸟 巧。经测定，作为供试品的每片猴头菌片中胞巧、腺嚷岭、尿巧、腺巧、鸟巧的平均含量分别 为 27.2f5]ig、28.78]ig、166.6 化g、94.06]ig、32.60]ig。
[0091] 实施例2
[0092] 本实施例用于说明本发明提供的猴头菌片的质量检测方法。
[0093] 本实施例在实施例1的基础上进一步说明通过本发明的质量检测方法可W测定猴 头菌片的指纹图谱与共有模式图谱的相似度。
[0094] (6)按照与实施例1的步骤（1)~巧)相同的方法测定10批猴头菌片的指纹图谱，然 后使用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对得到的10批猴头菌片的指纹图谱进行分析，得 到猴头菌片的共有模式图谱(请见图2,其中R为共有模式图谱，Sl至SlO分别为10批猴头菌 片的指纹图谱），W及运10批猴头菌片的指纹图谱与共有模式图谱的相似度(结果见表3)， 相似度均大于0.90。
[0095] 表3猴头菌片HPlX指纹图谱相似度评价
[0096]
[0097] 注:Sl批号140401，S2批号141001，为长春迪瑞制药有限公司的猴头菌片；
[0098] S3批号140701，S4批号140528,为上海华源安徽仁济制药有限公司的猴头菌片；
[0099] S5批号140213,为上海雷允上药业有限公司的猴头菌片；
[0100] S6批号140501，S7批号140325,为湖北襄阳隆中药业集团有限公司；
[0101] S8批号140408，S9批号140522, SlO批号140528,为广州白云山和记黄捕中药有限 公司的猴头菌片。
[0102] 步骤(6)的共有模式图谱中有16个特征共有峰，其中2号峰为胞巧、8号峰为腺嚷 岭、9号峰为尿巧、12号峰为腺巧、13号峰为鸟巧，其中的9号峰为参照峰，也是最强色谱峰。
[0103] 共有模式图谱的总长度为60min，其中单峰面积超过总峰面积1%的峰有10个，它 们是1~16号峰，单峰面积超过总峰面积5%的峰有6个，它们是5号峰、7号峰、8号峰、9号峰、 12号峰、15号峰，单峰面积超过总峰面积15 %的有2个，它们是9号峰和12号峰，单峰面积超 过总峰面积25 %的有1个，它是9号峰。
[0104] 上述16个特征共有峰具体如下，
[0105] 1号峰的平均保留时间RT为10.46min，RSD为0.33 %，峰面积为125.982, RSD为 35.38%;
[0106] 2号峰的平均保留时间RT为12.04min，RSD为0.38 %，峰面积为198.013, RSD为 41.68%;
[0107] 3号峰的平均保留时间RT为12.09min，RSD为0.24 %，峰面积为88.825, RSD为 70.37%;
[010引 4号峰的平均保留时间RT为12.62min，RSD为0.15%，峰面积为257.720，RSD为 59.50%;
[0109] 5号峰的平均保留时间RT为13.09min，RSD为0.34%，峰面积为625.366，RSD为 42.44%；
[0110] 6号峰的平均保留时间RT为15.51min，RSD为0.32 %，峰面积为102.070, RSD为 51.89%;
[0111] 7号峰的平均保留时间RT为17.19min，RSD为0.31 %，峰面积为353.710，RSD为 60.76%;
[0112] 8号峰的平均保留时间RT为18.31min，RSD为0.61 %，峰面积为675.391，RSD为 27.70%;
[0113] 9号峰的平均保留时间RT为23.26min，RSD为0.39 %，峰面积为1959.539, RSD为 46.88%;
[0114] 10号峰的平均保留时间RT为24.96min，RSD为0.49 %，峰面积为178.417, RSD为 25.76%;
[0115] 11号峰的平均保留时间RT为27.29min，RSD为0.26%，峰面积为141.349，RSD为 27.14%;
[0116] 12号峰的平均保留时间RT为34.36min，RSD为0.50%，峰面积为1170.988，RSD为 26.76%;
[0117] 13号峰的平均保留时间RT为43.95min，RSD为0.37 %，峰面积为282.908, RSD为 87.40%;
[0118] 14号峰的平均保留时间RT为45.09min，RSD为0.40 %，峰面积为194.799, RSD为 64.99%;
[0119] 15号峰的平均保留时间RT为46.49min，RSD为0.41%，峰面积为501.655，RSD为 33.:34%;
[0120] 16号峰的平均保留时间RT为48.19min，RSD为0.44%，峰面积为237.035，RSD为 36.89%。
[0。1] 实施例3
[0122] 本实施例用于说明本发明提供的猴头菌片的质量检测方法。
[0123] 在实施例1和2的基础上，本实施例通过采用本发明的质量检测方法，测定了其他1 批猴头菌片的胞巧、腺嚷岭、尿巧、腺巧和鸟巧的含量，W及其与共有模式图谱的相似度。具 体步骤如下；
[0124] 取猴头菌片（批号：150322,广州白云山和记黄捕中药有限公司），按照实施例1的 步骤（1)~（5)相同的方法，测定该猴头菌片的胞巧、腺嚷岭、尿巧、腺巧和鸟巧的含量分别 为 26.9 祉g、29.0化邑、167.1 Iug、94.45]ig、32.88]ig。
[0125] 取该批猴头菌片，按照实施例1的步骤(1)~巧)相同的方法测定其指纹图谱，并使 用中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算其与实施例2中的步骤(6)的共有模式图谱的相 似度，其相似度为0.92。
[0126] 尽管本发明已进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的 条件下，可进行各个条件的适当变化。可W理解，本发明不限于所述实施方案，而归于权利 要求的范围，其包括所述每个因素的等同替换。
【主权项】
1. 一种猴头菌片的质量检测方法，其特征在于，该方法包括如下步骤： (1) 制备混合标准品溶液： 精密称取适量胞苷、腺嘌呤、尿苷、腺苷和鸟苷对照品，加水配制成每ImL含胞苷1~20μ g、腺噪呤1~20yg、尿苷20~40yg、腺苷20~40yg、鸟苷1~20yg的混合标准品溶液，优选为 每ImL含胞苷5~9yg、腺噪呤3~7yg、尿苷25~35yg、腺苷25~35yg、鸟苷2~6yg的混合标准 品溶液； (2) 制备供试品溶液： 取猴头菌片，去包衣，研细，精密称取，置于具塞锥形瓶中，加水，密塞，称定重量，超声 提取，放冷，再称重量，用水补足减失的重量，离心，滤过，取续滤液，即得供试品溶液； (3) 色谱条件： 以C18色谱柱，以甲醇-0.08~0.30 % vol %磷酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，柱温:21 ~30°C，紫外检测波长：220~280nm，流速:0 · 40~1 · 20mL · min-1，洗脱时间：50~IOOmin; (4) 绘制标准曲线并回归计算： 取所述混合标准品溶液，分别进样2、5、10、15、20、25yL注入高效液相色谱仪，按照步骤 (3)的色谱条件重复进样测定3次，记录色谱峰，以yg计的进样量X为横坐标，峰面积平均值Y 为纵坐标，绘制标准曲线并进行回归计算，分别得到胞苷、腺嘌呤、尿苷、腺苷和鸟苷的线性 关系； (5) 测定供试品溶液： 精密吸取所述供试品溶液注入高效液相色谱仪，按照步骤(3)的色谱条件得到指纹图 谱，记录峰面积，并按照步骤(4)得到的各线性关系计算胞苷、腺嘌呤、尿苷、腺苷和鸟苷的 平均含量。2. 根据权利要求1所述的质量检测方法，其特征在于，所述方法还包括： (6) 按照与步骤（1)~（5)相同的方法测定10批猴头菌片的指纹图谱，然后使用指纹图 谱相似度评价系统对所得10批猴头菌片的指纹图谱进行分析，得到猴头菌片的共有模式图 谱，以及这10批猴头菌片的指纹图谱与共有模式图谱的相似度。3. 根据权利要求1或2所述的质量检测方法，其特征在于，所述方法还包括： (7) 按照与步骤（1)~（5)相同的方法测定任意批次的猴头菌片的胞苷、腺嘌呤、尿苷、 腺苷和鸟苷的含量;和/或 (8) 按照与步骤（1)~（5)相同的方法测定任意批次的猴头菌片的指纹图谱，并使用相 似度评价系统计算其与步骤(6)的共有模式图谱的相似度。4. 根据权利要求1至3中任一项所述的质量检测方法，其特征在于，在步骤（1)中，精密 称取适量胞苷、腺嘌呤、尿苷、腺苷和鸟苷对照品，分别加水配制为每ImL含168.80yg胞苷、 57.50yg腺嘌呤、199.20yg尿苷、198. OOyg腺苷、51.60yg鸟苷的五份溶液，然后从这五份溶 液中分别取适量并混合，加水配制为每ImL含胞苷6.75yg、腺嘌呤4.60yg、尿苷31.87yg、腺 苷31.68yg、鸟苷4.13yg的混合标准品溶液。5. 根据权利要求1至4中任一项所述的质量检测方法，其特征在于，所述步骤(2)为： 取猴头菌片，去包衣，研细，精密称取0.25~1.50g，置于具塞锥形瓶中，精密加入20mL 水，密塞，称定重量，超声提取20~60min，放冷，再称重量，用水补足减失的重量，离心，滤 过，取续滤液，即得供试品溶液;优选地，精密称取〇. 5g，超声提取30min;更优选地，4000r · min-1离心，0.22μηι滤膜滤过。6. 根据权利要求1至5中任一项所述的质量检测方法，其特征在于，所述步骤(3)为： 以C18色谱柱，以甲醇-0.1 % vol %磷酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，柱温:26°C，紫外 检测波长:260nm，流速:0 · 5mL · min-1，洗脱时间：60min 〇7. 根据权利要求1至6中任一项所述的质量检测方法，其特征在于，步骤(3)中梯度洗脱 的条件为： 0分钟时，流动相A为占流动相总体积0 %的甲醇、流动相B为占流动相总体积100 %的 0.1 % vol %磷酸水溶液； 25分钟时，流动相A为占流动相总体积0.2 %的甲醇、流动相B为占流动相总体积99.8 % 的0.1 % vol %磷酸水溶液； 30分钟时，流动相A为占流动相总体积0.5 %的甲醇、流动相B为占流动相总体积99.5 % 的0.1 % vol %磷酸水溶液； 35分钟时，流动相A为占流动相总体积3.5 %的甲醇、流动相B为占流动相总体积96.5 % 的0.1 % vol %磷酸水溶液； 45分钟时，流动相A为占流动相总体积3.8 %的甲醇、流动相B为占流动相总体积96.2 % 的0.1 % vol %磷酸水溶液； 60分钟时，流动相A为占流动相总体积4.2 %的甲醇、流动相B为占流动相总体积95.8 % 的0.1 % vol %磷酸水溶液。8. 根据权利要求1至7中任一项所述的质量检测方法，其特征在于，步骤(4)中的回归计 算的结果为:胞苷的回归方程为￥ = 3621.9乂+0.6092^为0.9999，线性范围为0.01~0.174 区；腺嘌呤的回归方程为￥=117761-2.3814 4为0.9999，线性范围为0.01~0.12以8;尿苷的 回归方程为Y = 5862.9x+5.3668，r为0.9999，线性范围为0.06~0.80yg;腺苷的回归方程为 ￥ = 6191.11+6.29114为0.9999，线性范围为0.06~0.8(^8;鸟苷的回归方程为￥ = 4327.6叉 +0 · 7886，r 为0 · 9999，线性范围为0 · 01 ~0 · 10yg。9. 根据权利要求2至8中任一项所述的质量检测方法，其特征在于，所述共有模式图谱 中有16个特征共有峰，其中2号峰为胞苷、8号峰为腺嘌呤、9号峰为尿苷、12号峰为腺苷、13 号峰为鸟苷;优选地，其中9号峰为参照峰，也是最强色谱峰;更优选地，所述共有模式图谱 的总长度为60min，其中单峰面积超过总峰面积1 %的峰有10个，它们是1~16号峰，单峰面 积超过总峰面积5 %的峰有6个，它们是5号峰、7号峰、8号峰、9号峰、12号峰、15号峰，单峰面 积超过总峰面积15%的有2个，它们是9号峰和12号峰，单峰面积超过总峰面积25%的有一 个，它是9号峰;进一步优选地，所述16个特征共有峰具体如下， 1号峰的平均保留时间RT为10.46min，RSD为0.33%，峰面积为125.982，RSD为35.38% ; 2号峰的平均保留时间訂为12.0411^11，1?0为0.38%，峰面积为198.013，1?0为41.68%; 3号峰的平均保留时间RT为12.09min，RSD为0.24%，峰面积为88.825，RSD为70.37% ; 4号峰的平均保留时间訂为12.6211^11，1?0为0.15%，峰面积为257.720，1?0为59.50%; 5号峰的平均保留时间訂为13.0911^11，1?0为0.34%，峰面积为625.366，1?0为42.44%; 6号峰的平均保留时间RT为15.51min，RSD为0.32%，峰面积为102.070，RSD为51.89% ; 7号峰的平均保留时间RT为17.19min，RSD为0.31 %，峰面积为353.710，RSD为60.76 % ; 8号峰的平均保留时间RT为18.31min，RSD为0.61 %，峰面积为675.391，RSD为27.70 % ; 9号峰的平均保留时间RT为23.26min，RSD为0.39 %，峰面积为1959.539, RSD为 46.88% ； 10号峰的平均保留时间RT为24.96min，RSD为0.49 %，峰面积为178.417，RSD为 25.76% ； 11号峰的平均保留时间RT为27.29min，RSD为0.26 %，峰面积为141.349, RSD为 27.14% ； 12号峰的平均保留时间RT为34.36min，RSD为0.50 %，峰面积为1170.988, RSD为 26.76% ； 13号峰的平均保留时间RT为43.95min，RSD为0.37 %，峰面积为282.908, RSD为 87.40% ； 14号峰的平均保留时间RT为45.09min，RSD为0.40 %，峰面积为194.799, RSD为 64.99% ； 15号峰的平均保留时间RT为46.49min，RSD为0.41 %，峰面积为501.655, RSD为 33.34% ； 16号峰的平均保留时间RT为48.19min，RSD为0.44 %，峰面积为237.035, RSD为 36.89%。10.根据权利要求1~9中任一项所述的质量检测方法所检测得到的猴头菌片剂。
【文档编号】G01N30/06GK105954417SQ201610323819
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年5月13日
【发明人】张慧晔, 唐海明, 王德勤, 李楚源
【申请人】广州白云山和记黄埔中药（亳州）有限公司, 广州白云山和记黄埔中药有限公司