白及中六种成分在Caco-2细胞模型中吸收转运量的测定方法
【专利摘要】本发明公开了白及中六种成分在Caco?2细胞模型中吸收转运量的测定方法，包括以下步骤：制备白及提取物溶液、作为对照品的标准溶液和内标溶液；建立人源结肠腺癌细胞系Caco?2细胞模型；通过Caco?2细胞模型制备出细胞悬液；通过UPLC?MS/MS测定6种成分的含量；按考马斯亮蓝染液蛋白测定试剂盒方法测定总蛋白含量，并计算细胞摄取量X=待测物总蛋白。本发明采用UPLC?MS/MS建立白及提取物中6个成分的分析方法，测定白及提取物在时间、浓度、温度、pH和P?gh抑制剂条件下对Caco?2细胞的吸收摄取影响，初步评价白及提取物的体内吸收特性。为白及提取物的口服制剂研发提供科学依据。
【专利说明】
白及中六种成分在Caco-2细胞模型中吸收转运量的测定方法
技术领域
[0001 ]本发明属于中药检测技术领域，尤其是设及白及中六种成分在化CO-2细胞模型中 吸收转运量的测定方法。
【背景技术】
[0002] 在口服药物吸收特性的体外研究中，人结肠腺癌细胞系(化CO-2细胞系）已成为经 典的细胞模型。化CO-2单层细胞模型在体外培养一段时间后，能分化出与肠上皮细胞相似 功能的微绒毛结构，含有小肠上皮细胞刷状缘相关酶系。可自发形成分化的上皮和紧密连 接组织，其细胞形态，特异性的标记酶和渗透特性都与小肠上皮细胞类似，并且重现性好， 与药物体内吸收具有良好的相关性，因此化CO-2细胞模型已广泛用于体外快速评价口服药 物的肠吸收特性
[0003] 白及为兰科植物白及[公striata 巧化]的干燥块茎，又 名甘根、白根、白巧、地螺丝等，主产于西南地区。白及最早收载于《神农本草经》，其正品收 载于2010年版《中国药典》，具收敛、止血、清热利湿、消肿生肌之功效，用于治疗咳血、吐血、 外伤出血、疮瘍肿毒、皮肤薇裂、溃瘍出血等症。国内外大量研究表明，白及属植物化学成分 具有多种类型，包括联节类、二氨菲类、菲类、联菲类、酿类衍生物等。其提取物中成分包括 曰-异下基苹果酸（a-Isobutylmalic acid)、4-(葡糖糖氧基）-肉桂酸葡萄糖氧基节醋 (BlestrosideKl ,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异下基苹果酸醋(Militarine)、4-(葡萄糖 氧)苄基-2-异下基苹果酸醋(Gy皿oside)、二氨菲1 (Dihy化ophenanthrenel)和1,4-二[4- (葡萄糖氧）苄基]-2-异下基苹果酸醋-2-[4-0-肉桂酷基-6-0-乙酷基]葡萄糖巧 (Gymnoside K)，便于区分，本实验将各成分分别依次命名为Bl、82、83、84、85和86。
[0004] 目前，关于白及提取物吸收特性尚未有报道。本实验采用UPLC-MS/MS建立白及提 取物中6个成分的分析方法，测定白及提取物在时间、浓度、溫度、pH和P-曲抑制剂条件下对 Caco-2细胞的吸收摄取影响，初步评价白及提取物的体内吸收特性。为白及提取物的口服 制剂研发提供科学依据。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种白及中六种成分在化CO-2细胞模型中吸收转运量的测 定方法，测定白及提取物在时间、浓度、溫度、pH和P-曲抑制剂条件下对化CO-2细胞的吸收 摄取影响，初步评价白及提取物的体内吸收特性。为白及提取物的口服制剂研发提供科学 依据。
[0006] 本发明通过W下技术方案实现该目的： 本发明的白及中六种成分在化CO-2细胞模型中吸收转运量的测定方法包括W下步骤： 步骤1:制备白及提取物溶液； 步骤2:用a-Isobuty Imal ic acid (BI)、Blestroside (B2)、Mi Ii tar ine(B3)、Gymnoside (B4)、Dihyhwhenant虹ene 1(B5) W及Gymnoside K(B6)制备作为对照品的标准溶液； 步骤3: W葛根素配制内标溶液； 步骤4:建立人源结肠腺癌细胞系化C0-2细胞模型； 步骤5:将步骤1得到的白及提取物溶液加入化C0-2细胞模型在培养箱中培养，取出培 养板吸走细胞表层的提取物W终止反应，用PBS溶液清洗两遍，加入细胞裂解液反复冻融W 裂解细胞，超声处理后分别得到含有白及提取物溶液的细胞悬液； 步骤6:取步骤5得到的含有白及提取物溶液的细胞悬液细胞悬液加入内标溶液，用乙 腊沉淀蛋白，满混，离屯、处理，通过UPLC-MS/MS测定上清液中6种成分的含量； 步骤7:取步骤5得到的含有白及提取物溶液的细胞悬液细胞悬液按考马斯亮蓝染液蛋 白测定试剂盒方法测定总蛋白含量，并计算细胞摄取量X=待测物总蛋白。
[0007] 步骤1中白及提取物溶液的制备方法如下：精密称取白及提取物200mg加入PBS缓 冲盐溶液定容至IOml,得20mg/ml的储备液，4°C下储存，临用前用PBS缓冲溶液稀释至所需 浓度。
[0008] 步骤2中作为对照品的标准溶液和步骤3中的内标溶液的制备方法如下:精密称取 白及提取物中各待测成分81、82、83、84、85和86^及葛根素（15)各1〇111邑，分别用甲醇定容至 IOml，作为储备液，于4°C下储存。
[0009] 步骤4建立人源结肠腺癌细胞系Caco-2细胞模型中Caco-2细胞培养方法如下： 化CO-2细胞株经复苏后，用10%-DMEM培养液接种于T-25培养瓶中，置于37 °C、5%0)2和相对 湿度90%的培养箱中培养，待细胞贴壁后更换培养液W洗去死细胞，之后隔一天更换一次培 养液，连续培养4~5天后于倒置显微镜下观察待细胞融合率约80%左右，吸去细胞表面的培 养液，用37°C预热的0.25%膜蛋白酶消化液进行消化，Wl :3的比例进行传代培养。其中， 10%-DMEM培养液中包括10%胎牛血清、1%双抗含青霉素 IOOU ? mL-i和链霉素 IOOiig ? mL-i、 89〇/〇1640培养基。
[0010] 步骤6中UPLC-MS/MS现憶时的液相条件如下：色谱柱:Waters B邸Cis (2.1 mmX 50 mm, 1.7 ym)柱；保护柱：Waters Van Guard 邸H Ci8 (2.1 mmX5 mm, 1.7 ym);流 速:0.35血-111111-1;柱溫:45°(：;流动相:0.1%甲酸乙腊(4)-0.1%甲酸水溶液(8);检巧化种 成分的梯度条件 0 ~3.0 min 5 %~65 % A, 3.0 ~3.5 min 65 % ~90 % A, 3.5 ~4.5 min 10 % A;进样体积2 yL。
[0011] 步骤6中UPLC-MS/MS测定时的质谱条件如下：电喷雾电离源化SI);毛细管电压：3 kV;离子源溫度：120 °C;去溶剂气溫度：350°C;去溶剂气:化，流速650 L ? IrS反吹气:化， 流速:50 L ? h-i;碰撞气:Ar，流速:0.16 mL ? min-i;质谱数据采集及处理软件为MassLynx V4.1工作站；扫描方式为多反应离子监测模式(MRM)。其中，白及提取物中成分Bl、B2、B3、 84、85、86^及葛根素（15)的离子对条件分别为111八169，129;5932,431.3;725.3,457.2; 457.2，285.1; ：347.1，332.1; 1059.3，791.3 和417，267。
[0012] 本发明利用化CO-2细胞单层细胞模型研究白及提取物的吸收摄取特性，方法是采 用UPLC-MS/MS考察白及提取物在不同提取物浓度、时间、溫度、抑和P-糖蛋白抑制剂条件下 对化CO-2细胞的吸收影响。本发明的方法结果表明白及提取物在化CO-2细胞中的吸收具有 浓度和时间依赖性，其中Bl和B5在摄取60min后趋于饱和;B6在25°C条件下吸收最好，其他 成分均在37°C条件下吸收最好;酸性环境下有利于白及提取物的吸收;加入P-糖蛋白抑制 剂维拉帕米和环抱菌素 A后发现，B5的摄取量显著性增加。可知白及提取物在化CO-2细胞中 的吸收机制可能为被动转运，酸性环境有利于各成分的吸收，且P-糖蛋白可能参与了 B5的 摄取过程。
[0013] 本发明采用UPLC-MS/MS建立白及提取物中6个成分的分析方法，测定白及提取物 在时间、浓度、溫度、pH和P-曲抑制剂条件下对化CO-2细胞的吸收摄取影响，初步评价白及 提取物的体内吸收特性。为白及提取物的口服制剂研发提供科学依据。
【具体实施方式】
[0014] 下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。
[00巧]实施例1: 1实验仪材 1.1仪器超高液相色谱-S重四级杆质谱联用仪（美国Waters公司）；C〇2培养箱 (I'hermo sci-entif ic);超净工作台（苏州净化设备总厂）；功能酶标仪（ThermoSOOl VARI0SKAN FLA甜）；倒置相差显微镜（日本Olympus)。
[0016] 1.2 试剂与试药 a-Isobutylmalic acid(Bl)、Blest;roside(B2)、Milita;rine (B3)、Gymnoside(B4)、Dihy化ophenanthrene I (B5) W及Gymnoside K(B6)皆为实验室前 期分离(批号20150305) ;PSS缓冲溶液(Solarbio);胎牛血清(G化CO) ;DMEM培养基(高糖， Gibco);膜蛋白酶(Gibco);双抗化yclone);考马斯亮蓝染液(南京建成生物工程研究所）； DMSO、甲醇、乙腊均为色谱纯;实验用水为超纯水;其他试剂均为分析纯。
[0017] 1.3细胞株Caco-2细胞株化海中科院），细胞传代数在50代W内。
[001引 2方法与结果 2.1提取物溶液的配制 精密称取白及提取物200mg加入PBS缓冲盐溶液(pH7.4，0.1M)定容至IOml，得20mg/ml 的储备液，4°C下储存，临用前用PBS缓冲溶液稀释至所需浓度。
[0019] 2.2标准溶液的配制 精密称取白及提取物中各待测成分81、82、83、84、85和86^及葛根素（15)各1〇111邑，分别 用甲醇定容至10ml，作为储备液，于4°C下储存。 2.3细胞的培养 Caco-2细胞株经复苏后，用10%-DMEM培养液（10%胎牛血清、1%双抗含青霉素 IOOU ? mL-哺链霉素 IOOiig ? mL-i、89%1640培养基)接种于T-25培养瓶中，置于37°C、5%CO沸相对湿 度90%的培养箱中培养，待细胞贴壁后(大约化)更换培养液W洗去死细胞，之后隔一天更换 一次培养液，连续培养4~5天后于倒置显微镜下观察待细胞融合率约80%左右，吸去细胞表 面的培养液，用37°C预热的0.25%膜蛋白酶消化液进行消化，Wl :3的比例进行传代培养。
[0020] 2.4白及提取物安全浓度范围考察 选取传代数在50代W内且处于对数生长期的化CO-2细胞，W密度为1.5~2 X IOMVmL 种植于96孔培养板中，每孔10化L，置于37 °C、5%0)2培养箱中培养2地。次日吸去培养液，实 验组分别加入10化L不同浓度的白及提取物溶液（用PBS缓冲盐溶液分别稀释至0.1、0.5、 2.5、5、15 mg ? m[i)，空白组加入10化L PBS缓冲盐溶液，每个浓度设置6个复孔，分别作用 化CO-2细胞4 h后每孔加入100 iiL MTT溶液(用PBS缓冲盐溶液配制成0.25 mg-mL-i)，继续 培养4 h，吸去上清液，每孔加入100化DMSO溶解结晶，于490nm波长处检测每孔吸光度OD 值。计算细胞存活率(药物组OD值/对照组OD值* 100 )，与空白组比较并分析白及提取物的安 全浓度范围。结果如图1所示：当白及提取物>2.5 mg ? mL-i，对化CO-2细胞的毒性作用逐渐 增大，因此，选择2.0 mg ? m[i的白及提取物进行后续试验考察。
[0021] 2.5化CO-2细胞的吸收特性方法 选取传代数在50代W内且处于对数生长期的化CO-2细胞，W密度为7 X IO5个/mL种植 于6孔培养板中，每孔500化，置于37°C、5%0)2培养箱中培养21天，前3天隔一天更换一次培 养液，之后每天更换一次。于第22天，吸去细胞表层的培养液，用37°C预热的PBS缓冲盐溶液 在培养箱中预培养30 min后，吸去缓冲盐溶液，W洗去单层细胞表面的杂质，然后加入用37 °(：的口85溶液配制的白及提取物，于培养箱中培养一定时间后，取出培养板吸走细胞表层的 提取物W终止反应，用4°C的PBS溶液清洗两遍，加入50化L 0.1% TritonX-IOO细胞裂解液， 反复冻融W裂解细胞，超声IOmin得细胞悬液，一部分取25化L细胞悬液加入50化内标溶液 (葛根素2 yg .HiL-I),用400化乙腊沉淀蛋白，满混，15000巧m离屯、lOmin，通过UPLC-MS/MS 测定上清液中6种成分的含量(mg)。另一部分取IOiiL细胞悬液按考马斯亮蓝染液蛋白测定 试剂盒方法测定总蛋白含量(g)，并计算细胞摄取量X=待测物(mg)/总蛋白（g)。
[0022] 2.6 UPLC-MS/MS分析条件 2.6.1 液相条件：色谱柱:Waters 肥H Cis (2.1 mm X 50 mm, 1.7 ym)柱;保护柱： Waters Van Guard 肥H Cis (2.1 mmX 5 mm, 1.7 ym);流速：0.35 mL .IIiin-I;柱溫：45 °C;流动相:0.1 %甲酸乙腊(A)-0.1 %甲酸水溶液(B);检测6种成分的梯度条件0~3.0 min 5 %~65 % A，3.0~3.5 min 65 % ~90 % A，3.5~4.5 min 10 % A;进样体积 2 化。
[0023] 2.6.2质谱条件：电喷雾电离源巧SI);毛细管电压:3 kV;离子源溫度:120 °C;去 溶剂气溫度:350°C;去溶剂气:化，流速650 L ? h-i;反吹气:化，流速:50 L ? h-i;碰撞气:Ar， 流速:0.16血-min-i;质谱数据采集及处理软件为MassLynx V4.1工作站;扫描方式为多反 应离子监测模式(MRM)。白及提取物中成分81、82、83、84、85、86^及葛根素（15)的离子对条 件分别为 m/zl69,129; 5932,431.3; 725.3,457.2; 457.2,285.1; 347.1,332.1; 1059.3， 791.3和417,267。
[0024] 2.7方法学考察 2.7.1专属性将空白细胞混悬液A、混合对照品溶液B和细胞样品C在建立的色谱条件 下进样分析，对比图A、B和C分析专属性。结果如图2所示:各成分的分离度良好，B1、B2、B3、 B4、B5、B6 W及葛根素(IS)保留时间分别为：1.55,1.49,1.81,1.70,2.98,3.11和 1.30。且细 胞悬液基质背景对成分的测定无干扰。
[0025] 2.7.2线性和检测线取25化L空白细胞混悬液，分别加入50化已配制成一系列不同浓 度的混合标准溶液，W及50化内标溶液，满混均匀后，用400化乙腊沉淀蛋白，其余操作按 "2.5"项下处理并进样分析。W待测物的峰面积与内标峰面积之比(A/Ai)为纵坐标Y，各物 质浓度(C)为横坐标X拟合线性方程，结果如表1所示:成分81、82、83、84、85和86的线性关系 良好;检测线可满足白及提取物后续实验中对细胞样品的检测要求。
[00%] 2.7.3准确度与精密度按"2.7.2"项下分别配制低、中、高3个浓度的细胞悬液质 控(QC)样品，每个浓度平行操作5次，连续测定3天，代入随行标准曲线中分别计算各物质的 浓度，结果表明该分析方法的准确度为89.73%~102.68%，日间RSD%为0.86%~9.39%，日内 RSD% 为 1.02% ~4.51〇/〇。
[0027] 2.7.4回收率按"2.7.2"项下分别配制低、中、高3个浓度的细胞悬液质控(QC)样 品，W及用初始流动相配制成对应浓度的混合标准溶液，分别重复进样3次，代入随行标准 曲线中分别计算各物质的浓度，W细胞样品和标准溶液的比值计算各成分的提取回收率， 结果显示成分的提取回收率均大于81%。
[00%] 2.7.5稳定性用空白细胞混悬液按"2.7.2"下配制成中浓度的细胞悬液质控 (QC)样品，室溫放置，分别在1、3、5 d进样分析，代入随行标准曲线中分别计算各物质的浓 度，其日间RSD% 分别为0.47%、0.59%、0.73%、0.66%、0.82% 和0.43〇/〇。
[00巧]2.9化CO-2细胞吸收特性考察内容： 2.9.1时间依赖性试验 将白及提取物(2.0 mg ?血-1)于Caco-2细胞中分别培养15、30、60、90、120、180111111，其 余同"2.5"项下操作，测定细胞悬液中各成分含量，计算细胞摄取量并采用GraphPad v5.0 软件作图，考察不同培养时间对Caco-2细胞吸收的影响。结果如图3所示:选择60min作为最 适解育时间较为合理。
[0030] 2.9.2浓度依赖性试验 用PBS溶液将白及提取物稀释至不同浓度(0.1、0.5、l、2.0、2.5mg?血-l)于化co-2细 胞中培养60min，其余同"2.5"项下操作，考察不同浓度的提取物对化CO-2细胞吸收摄取的 影响。结果如图4所示:提取物浓度在0. ^2.5 mg ? ml/i范围内，各成分在化CO-2细胞的摄取 量随浓度的增加呈线性增加，其回归相关系数R2均大于0.900,说明W上6种成分在化CO-2 细胞中的吸收摄取特性均表现出浓度依赖性，结合安全浓度范围，选择2.0 mg ? ml/i作为后 续试验中提取物浓度。
[0031] 2.7.3 pH依赖性试验 将白及提取物(2.0 mg-ml/i)溶于不同pH环境的PBS缓冲溶液(pH 4.0、6.0、7.4)中， 分别于化CO-2细胞中培养60min，其余同"2.5"项下操作，考察不同pH介质对细胞吸收摄取 的影响。结果如图5所示:Bl在抑6.0环境中吸收较好，其余成分在抑4.0环境中吸收较好，综 合考虑选择PH6.0的培养环境进行后续实验。
[0032] 2.7.4溫度依赖性试验 将白及提取物(2.0 mg ? mL-i，p册.0)于化CO-2细胞中分别在不同溫度(4、25、37°C)下 培养60min，其余同"2.5"项下操作，考察不同溫度对细胞吸收摄取的影响。结果如图6所示： B6在25°C条件下摄取量最高，其余成分的摄取量随溫度升高而增加，综合考虑选择培养溫 度为37°C进行后续实验。
[0033] 2.7.5 P-曲抑制剂对化CO-2细胞吸收摄取的影响 基于W上考察，用PH6.0的PBS缓冲溶液分别配制对照组白及提取物（2.0 mg ? ml/i)， 实验组含维拉帕米巧0 yg-ml/i)的同浓度白及提取物溶液、含环抱菌素 A(l〇 的 同浓度白及提取物溶液，于37°C、5%(X)2培养箱中共同培养60 min后测定有无抑制剂对 化CO-2细胞吸收摄取的影响。结果见表2所示：实验组B5的摄取量较对照组有显著性差异 (户<口.口5)，其余成分的细胞摄取量较对照组无显著性差异(AO.05)，说明白及提取物中B5 在化CO-2细胞中的吸收受P-甜的影响。
[0034] 3小结与讨论 本实验采用化CO-2单层细胞模型，通过UPLC-MS/MS测定白及提取物中6个成分在不同 时间、浓度、pH、溫度和P-gp抑制剂条件下对化CO-2细胞的吸收摄取影响，初步评价白及提 取物的吸收摄取特性。本实验发现：白及提取物在0.1~2.5 mg ? ml/1范围内吸收摄取受时 间、浓度、pH的影响，Caco-2细胞的摄取量与药物浓度呈良好的线性关系，由于在各自相应 浓度范围内，细胞摄取表现出一级速率过程的特征，因此说明白及提取物的吸收机制可能 为被动扩散。酸性环境有利于白及提取物的吸收，运可能由于Bl为有机酸类，B2、B3、B4和B6 为糖巧类，W及B5是含有=个酪径基的菲类化合物，各成分都偏酸性，在酸性条件下W非解 离形式被摄取，而在中性偏碱性条件下水解成盐导致膜通透性降低，摄取量相对减少。随溫 度的增加，摄取越接近生理环境(37°C)细胞摄取量也随之增加(B23除外），而B23在常溫(25 °C)条件下吸收较好，通过考察白及提取物中6种成分的吸收摄取是否受P-糖蛋白抑制剂的 影响，结果发现维拉帕米和环抱菌素 A能明显促进B5的细胞摄取(代化口巧，说明B5可能是P- 即的底物，B5为二氨菲类化合物，疏水性较强，其肠道吸收易受P-糖蛋白的影响。因此需通 过体内实验(肠灌流、肠外翻)进一步研究白及提取物的口服吸收机制，W期为白及提取物 口服制剂的开发研究提供依据。
[0035]当然，W上只是本发明的具体应用范例，本发明还有其他的实施方式，凡采用等同 替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明所要求的保护范围之内。
【主权项】
1. 白及中六种成分在CaC〇-2细胞模型中吸收转运量的测定方法，其特征在于包括以下 步骤： 步骤1:制备白及提取物溶液； 步骤2:用α-Isobutylmalic acid(Bl)、Blestroside(B2)、Militarine(B3)、Gymnoside (B4)、Dihydrophenanthrene I (B5)以及Gymnoside IX(B6)制备作为对照品的标准溶液； 步骤3:以葛根素配制内标溶液； 步骤4:建立人源结肠腺癌细胞系Caco-2细胞模型； 步骤5:将步骤1得到的白及提取物溶液加入Caco-2细胞模型在培养箱中培养，取出培 养板吸走细胞表层的提取物以终止反应，用PBS溶液清洗两遍，加入细胞裂解液反复冻融以 裂解细胞，超声处理后分别得到含有白及提取物溶液和系列标准溶液的细胞悬液； 步骤6:取步骤5得到的含有白及提取物溶液的细胞悬液细胞悬液加入内标溶液，用乙 腈沉淀蛋白，涡混，离心处理，通过UPLC-MS/MS测定上清液中6种成分的含量； 步骤7:取步骤5得到的含有白及提取物溶液的细胞悬液细胞悬液按考马斯亮蓝染液蛋 白测定试剂盒方法测定总蛋白含量，并计算细胞摄取量X=待测物总蛋白。2. 根据权利要求1所述的白及中六种成分在Caco-2细胞模型中吸收转运量的测定方 法，其特征在于步骤1中白及提取物溶液的制备方法如下：精密称取白及提取物200mg加入 PBS缓冲盐溶液定容至IOml，得20mg/ml的储备液，4°C下储存，临用前用PBS缓冲溶液稀释至 所需浓度。3. 根据权利要求1所述的白及中六种成分在Caco-2细胞模型中吸收转运量的测定方 法，其特征在于步骤2中作为对照品的标准溶液和步骤3中的内标溶液的制备方法如下:精 密称取白及提取物中各待测成分81、82、83、84、85和86以及葛根素（15)各1〇!^，分别用甲醇 定容至IOml，作为储备液，于4°C下储存。4. 根据权利要求1所述的白及中六种成分在Caco-2细胞模型中吸收转运量的测定方 法，其特征在于步骤4建立人源结肠腺癌细胞系Caco-2细胞模型中Caco-2细胞培养方法如 下：Caco-2细胞株经复苏后，用10%-DMEM培养液接种于T-25培养瓶中，置于37 °C、5%C02和 相对湿度90%的培养箱中培养，待细胞贴壁后更换培养液以洗去死细胞，之后隔一天更换一 次培养液，连续培养4~5天后于倒置显微镜下观察待细胞融合率约80%左右，吸去细胞表面 的培养液，用37°C预热的0.25%胰蛋白酶消化液进行消化，以1:3的比例进行传代培养。5. 根据权利要求4所述的白及中六种成分在Caco-2细胞模型中吸收转运量的测定方 法，其特征在于:所述I〇%-DMEM培养液中包括10%胎牛血清、1%双抗含青霉素 IOOU · ml/1和链 霉素 IOOyg · mL-\89%1640培养基。6. 根据权利要求1所述的白及中六种成分在Caco-2细胞模型中吸收转运量的测定方 法，其特征在于:步骤6中UPLC-MS/MS测定时的液相条件如下：色谱柱:Waters BEH C18 (2.1 mmX50 mm，1 ·7 μπι)柱；保护柱：Waters Van Guard BEH Ci8 (2.1 mmXf5 mm，1.7 μπι); 流速:0.35 mL IirT1;柱温:45°C;流动相:0.1 %甲酸乙腈(A)-O.I %甲酸水溶液(B);检测6 种成分的梯度条件 〇 ~3.0 min 5 %~65 % A，3·0~3·5 min 65 % ~90 % A，3·5~4.5 min 10 % A;进样体积2 μL。7. 根据权利要求6所述的白及中六种成分在Caco-2细胞模型中吸收转运量的测定方 法，其特征在于:步骤6中UPLC-MS/MS测定时的质谱条件如下：电喷雾电离源(ESI);毛细管 电压:3 kV;离子源温度：120 °C;去溶剂气温度:350°C;去溶剂气:N2，流速650 L .IT1;反吹 气：N2，流速：50 L .IT1;碰撞气:Ar，流速:0.16 mL· HiirT1;质谱数据采集及处理软件为 MassLynx V4.1工作站;扫描方式为多反应离子监测模式(MRM)。8.根据权利要求7所述的白及中六种成分在Caco-2细胞模型中吸收转运量的测定方 法，其特征在于：白及提取物中成分8132、83、84、85、86以及葛根素（15)的离子对条件分别 为m/zl69，129;5932,431.3 ;725.3,457.2;457.2,285.1;347·1,332.1;1059.3,791.3和 417,267。
【文档编号】G01N30/02GK105954411SQ201610298953
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年5月9日
【发明人】黄勇, 李勇军, 郑林, 陆苑, 兰燕宇, 王爱民, 孙佳, 巩仔鹏, 李月婷, 陈思颖, 杨畅
【申请人】贵州医科大学