癌症中的tert(端粒酶逆转录酶)基因启动子突变的制作方法
【专利说明】
[00011 本申请享有起初在美国的两个临时申请61/833773(2013年6月11日提交)和61/ 805710(2013年3月27日提交）的所授予的权益，这里对两个临时申请做了完整参考引用和 整合。
[0002] 本发明得到了美国国立卫生研究院R01CA134225的资助，政府享有一定的发明权。
[0003] 本申请包含有序列表格。已通过EFS-网络提交电子板，以ASCII文本形式，文件名 为"P12422-03_ST25.txt"。序列列表的大小为1605字节，2014年3月27日产生，在此做完整 整合。
技术领域
[0004] 本发明涉及癌症领域。更具体地，本发明提供了与某些癌症中基因启动子突变有 关的方法和组合系统。
【背景技术】
[0005] 甲状腺癌是最常见的经典的内分泌恶性肿瘤，其发病率已经在过去的几十年里迅 速攀升，包括在美国以及其他工业化国家。甲状腺癌中组织学上分类为四组:乳头，滤泡，髓 样，和未分化甲状腺癌。如果诊断在早期阶段，甲状腺癌是一个好治疗的疾病。总体而言，患 者5年平均存活率为97%。然而，有高度期进展侵袭性甲状腺癌的病人5年存活率较差，约 40%。举例来说，肿瘤大，有浸润性，或有转移的病人预后很差。还有，对失去放射性碘摄取 能力的转移性疾病，现没有有效的治疗方法，这些患者1 〇年存活率小于15 %。
[0006] 尽管相对少见（占美国所有恶性肿瘤的1%)，甲状腺癌的发病率在美国从1984年 至2004年间增加了一倍。1995年至2004年，甲状腺癌是第三个增长最快的癌症，仅次于腹 膜，大网膜，肠系膜及癌症和其他消化道癌症。同样，大幅增加甲状腺癌的发病率也已在加 拿大，澳大利亚，以色列和一些欧洲国家的观察到。因此，需要对甲状腺癌的分子机制有更 好的理解，以帮助开发新的诊断工具和更好的治疗选择。
【发明内容】
[0007] 本发明是基于或至少部分地基于下述发现，即在某些癌，包括甲状腺癌，膀胱癌和 脑胶质母细胞瘤中的端粒酶逆转录酶(TERT)基因启动子区的某些多发突变，因此代表新的 诊断，风险预后评估和治疗靶点和手段。
[0008] 更具体地讲，通过大量的原发肿瘤的基因测序，我们探讨在端粒酶逆转录酶 (TERT)基因的启动子突变1，295,228 C>T和1，295,250 C>T(分别被称为C228T和C250T)，其 分别对应从翻译起始位点的-124 C>T和-146 C>T。我们发现C228T突变率在良性甲状腺肿 瘤中为0/85(0.0 % )，在乳头状甲状腺癌(PTC)中为30/257(11.7 % )，在滤泡状甲状腺癌 (FTC)为9/79( 11.4%)，在低分化甲状腺癌(PDTC)中为3/8(37.5%)，在未分化甲状腺癌 (ATC)中为23/54(42.6%)，在甲状腺癌的细胞系中为8/12(66.7%) X250T突变是不常见 的，但与C228T突变相互排斥的，这两个突变一并发生在11/79( 13.9%)甲状腺滤泡状癌， 25/54(46.3%)未分化甲状腺癌，11/12(91.7%)甲状腺癌细胞系。在乳头状甲状腺癌各亚 型中，C228T突变被发现在4/13(30.8%)高细胞亚型PTC(TCPTC) ,23/187(12.3%)常规亚型 PTC(CPTC)，和2/56(3.6%)滤泡亚型？1'(：$￥?1'〇。在16例检测的甲状腺髓样癌样本中没有 发现TERT突变。C228T突变与BRAF V600E突变在PTC中相关，存在于19/104(18.3%)BRAF突 变阳性的PTC，但只存在于11/153 (7.2 % )的BRAF突变阴性PTC样品（P = 0.0094)。相反地， BRAF突变发现存在于85/227(37.4% )C228T突变阴性的PTC样本，而在19/30(63.3% )C228T 突变阳性的PTC。因此，就我们所知，这是第一次证明TERT启动子突变在甲状腺癌存在，在具 有高度期高侵袭性甲状腺癌TCPTC，PDTC，ATC和BRAF突变阳性的PTC尤其常见，揭示了甲状 腺癌新的遗传背景。另外，如本文进一步描述的，我们发现，高度重复发生的TERT启动子突 变也高频率地发生在膀胱癌和脑胶质细胞瘤中。
[0009] 因此，在一个方面，本发明提供了处理甲状腺癌的新策略。在一个代表性的实施方 案中，用于治疗患有甲状腺癌的病人个体的方法包括下列步骤(a)获得来自所述病人的生 物样品；（b)用该获得的生物样品做化验检测，以确定1,295,228 C>T(C228T)和1，295,250C >T(C250T)突变，该两个突变对应于从端粒酶逆转录酶(TERT)基因启动子的翻译起始位点 的-124 OT和-146 C>T; (c)如果检测到了C228T和/或C250T突变，则可确定该病人有或可 能发展成高危险高侵袭的甲状腺癌；（d)检测出这样有或可能发展成高危险高侵袭的甲状 腺癌的患者后，可做更准确的风险预后评估，然后可对患者选用一种或多种恰当的治疗方 式，进行针对性的更有效的合理治疗。
[0010] 在一个具体的实施方案中，步骤(b)的测定包括从TERT启动子的翻译起始位点启 动子区域-124和-146的测序。在另一具体实施方案中，步骤(b)的测定包括以下步骤：（i)提 取从生物样品中的DNA; ( ?? )使用的引物特异性杂交的TERT基因的DNA; (iii )通过聚合酶链 反应(PCR)放大TERT基因启动子，其对应包含从TERT启动子的翻译起始位点的-124和-146 区域；（iv)测序扩增产物以确定C228T和/或C250T突变的存在。在某些实施方案中，引物包 含SEQ ID N0:2和/或SEQ ID N0:3。检测方法不限于此，也可用其它检测手段检测两个TERT 启动子突变。
[0011] 在具体的实施方案中，对高进展性的甲状腺癌的治疗方法包含甲状腺全切，侧切， 放射性碘治疗，和它们的组合。在进一步的实施方案中，治疗方法包括给予病人TERT抑制剂 药物。
[0012] 在另一个方面，本发明提供了鉴定受试者的疾病是否为具有或可能发展成高侵袭 性甲状腺癌，及它们的治疗方法。在一个实施方案中，用于鉴定受试者为具有或可能发展侵 袭性甲状腺癌的方法包括(a)获得来自所述受试者的生物样品；（b)对来自所述对象获得 的样品的测定以确定1，295,228 C>T(C228T)和1,295,250 C>T(C250T)的突变。这些突变对 应于从端粒酶逆转录酶(TERT)基因的启动子的翻译起始位点的-124 C>T和-146 C>T;和 (c)如果C228T和/或C250T突变存在，则确定所述受试者为患有或可能发展成高危险的侵袭 性甲状腺癌;在具体的实施方案中，步骤(b)的测定包括对TERT启动子从翻译起始位点区域 包括-124和-146的测序。检测方法不限于此，也可用其它检测手段检测两个TERT启动子突 变。
[0013] 在另一具体实施方案中，步骤(b)的测定包括以下步骤：（i)提取从生物样品中的 DNA; ( ? )使用的引物特异性杂交的TERT基因的DNA; (iii )通过聚合酶链反应(PCR)放大TERT 基因启动子，其包含从TERT启动子的翻译起始位点的-124和-146区域；（iv)测序扩增产物 以确定C228T和/或C250T突变的存在。在某些实施方案中，引物包含SEQ ID N0:2和/或SEQ ID N0:3。检测方法不限于此，也可用其它检测手段检测两个TERT启动子突变。
[0014] 在某些实施方案中，该方法进一步包括施用治疗形式适合受试者患有或可能发展 成有侵袭性甲状腺癌的治疗。在具体的实施方案中，治疗方法包括甲状腺全切，侧切，放射 性碘治疗，及它们的组合。在进一步的实施方案中，治疗方法包括给予所述受试者TERT抑制 剂药物。
[0015] 在另一个方面，本发明提供了治疗具有膀胱癌病人的方法。在一个实施方案中，用 于治疗患有膀胱癌的个体的方法包括(a)获得来自所述受试者的生物样品；（b)对从受试者 对象获得的样品进行测定以确定1，295,228 C>T(C228T)和1，295,250 C>T(C250T)突变的 存在。该两突变对应于从端粒酶逆转录酶（TERT)基因的启动子的翻译起始位点-124 C>T 和-146 C>T; (c)如果C228T和/或C250T突变被测到，则可确定所述受试者具有或可能发展 为膀胱癌，或膀胱癌复发，或有高恶性的膀胱癌；（d)对这样的病人做相应的针对性的膀胱 癌治疗制定最佳方案。
[0016] 在某些实施方案中，生物样品是尿样。在一个具体的实施方案中，步骤(b)的测定 包括TERT启动子从翻译起始位点的-124和-146区域测序。在另一具体实施方案中，步骤(b) 的测定包括以下步骤：（i)提取生物样品中的DNA;( ii )用特异引物特异性地杂交TERT基因 DNA; (i i i)用聚合酶链反应(PCR)放大TERT基因，其包含的区域从TERT启动子的翻译起始位 点的-124和-146区域;和（iv)测序扩增产物以确定C228T和/或C250T突变的存在。在某些实 施方案中，引物包含SEQ ID N0:2和/或SEQ ID N0:3。检测方法不限于此，也可用其它检测 手段检测两个TERT启动子突变；
[0017] 在另一个方面，本发明提供了鉴定受试者为具有或可能发展为膀胱癌，和治疗它 们的方法。在一个实施方案中，用于鉴定受试者为具有或可能发展为膀胱癌的方法包括(a) 获得来自所述受试者的生物样品；（b)对来自所述对象获得的样品测定，以确定突变1，295， 228 C>T(C228T)和1,295,250 C>T(C250T)的存在，其对应于从端粒酶逆转录酶(TERT)基因 的启动子的翻译起始位点的-124 OT和-146 C>T;(c)如果C228T和/或C250T突变的得到 鉴定存在，则可确定所述受试者为患有或可能发展为膀胱癌，或有高危险侵袭性的膀胱癌。 在一个具体的实施方案中，步骤(b)的测定包括TERT启动子区域(包括从TERT启动子的翻译 起始位点的-124和-146)的测序。
[0018] 在另一具体实施方案中，步骤(b)的测定包括以下步骤：（i)提取从生物样品中的 DNA; ( ? )用特异的引物特异性的杂交TERT基因 DNA; (iii )通过聚合酶链反应(PCR)放大TERT 基因，其包含从TERT启动子的翻译起始位点的-124和-146区域;和（iv)测序扩增产物以确 定C228T和/或C250T突变的存在。在某些实施方案中，引物包含SEQ ID N0:2和/或SEQ ID N0:3。检测方法不限于此，也可用其它检测手段检测两个TERT启动子突变。在具体实施方案 中，生物样品是尿样或是其它生物样品。
[0019] 在具体的实施方案中，膀胱癌治疗方式包括一种或多种方法，包括但不限于，经尿 道切除术(使用电灼），根治性膀胱切除，部分切除，和尿分流;放射疗法，化学疗法(例如，膀 胱内）；和生物治疗，如BCG(卡介苗）。在进一步的实施方案中，治疗方法包括给予所述受试 者TERT抑制剂药物。
[0020] 另一方面，本发明提供了治疗具有胶质母细胞瘤检测处理的方法。在一个实施方 案中，用于治疗具有胶质母细胞瘤受试者的方法包括(a)获得来自受试者的生物样品；（b) 对来自所述对象获得的样品的测定，以确定在1，295,228 C>T(C228T)和1,295,250 C>T (C250T)突变，其对应于从端粒酶逆转录酶(TERT)基因的启动子的翻译起始位点的-124 C> T和-146C>T;(c)如果C228T和/或C250T突变被识别，则确定所述受试者具有或有可能发展 成胶质细胞瘤，并有独特的风险程度和预后发展；（d)给于病人以合适的一个或一个以上的 治疗方式。在一个具体的实施方案中，步骤(b)的测定包括从TERT启动子的翻译起始位点 的-124和-146区域测序。
[0021] 在另一具体实施方案中，步骤(b)的测定包括以下步骤：（i)提取从生物样品中的 DNA;( ? )用特异引物特异性地杂交TERT基因 DNA;(iii)放大通过聚合酶链反应(PCR)TERT基 因，其包含从TERT启动子的翻译起始位点的-124和-146区域；（i v)测序扩增产物以确定 C228T和/或C250T突变的存在。在实施方案中，引物包含SEQ ID N0:2和/或SEQ ID N0:3。检 测方法不限于此，也可用其它检测手段检测两个TERT启动子突变。
[0022] 在又一个方面，本发明提供了鉴定受试者为具有或可能发展成胶质细胞瘤，以及 它们的治疗方法。
[0023] 在一个实施例中，一个方法用于鉴定受试者为具有或可能发展为胶质母细胞瘤包 括(a)获得来自所述受试者的生物样品；（b)对来自受试者的样品做测定，以确定1，295,228 01'(02281')和1，295,250 01'(02501')突变在，其对应于-124 01'和-146 01'(从端粒酶逆 转录酶TERT基因的启动子的翻译起始位点起）；（c)如果C228T和/或C250T突变得到识别，则 可鉴定所述受试者为患有或可能发展成胶质细胞瘤。在一个具体的实施方案中，步骤(b)包 括对包含-124和-146(从TERT启动子的翻译起始位点起)的TERT启动子区域测序。
[0024] 在另一具体实施方案中，步骤(b)的测定包括以下步骤：（i)提取生物样品中的 DNA; ( ? )用特异的引物特异性杂交TERT基因的DNA; (iii )通过聚合酶链反应(PCR)放大TERT 基因，其包含-124和-146 (从TERT启动子的翻译起始位点起）的区域；（i v)测序扩增产物以 确定C228T和/或C250T突变的存在。在某些实施方案中，引物包含SEQ ID N0:2和/或SEQ ID N0:3。检测方法不限于此，也可用其它检测手段检测两个TERT启动子突变。在具体实施方案 中，生物样品是肿瘤组织，或穿刺样本，或脑脊液，或其它生物样品。
[0025] 在具体的实施方案中，治疗脑胶质细胞瘤包括一个或多个外科手术，放射治疗(例 如，3维放射治疗，调强放射疗法，立体定向放射治疗，和质子束放射治疗）；化疗（例如，鞘 内）；和生物治疗（例如，酪氨酸激酶抑制剂疗法，血管内皮生长因子(VEGF)疗法，树突呼叫 疫苗疗法和基因疗法）。在进一步的实施方案中，治疗方法包括给予所述受试者TERT抑制剂 药物。
【附图说明】
[0026]图1.测序人类的TERT启动子电泳测序图。所示为人TERT启动子的两个含有突变的 DAN序列的代表性电泳测序图。1A:使用有正链引物进行测序获得的DNA链，其中显示TERT启 动子突变C228T和C250T，包括各种甲状腺癌细胞系和甲状腺癌的样品。图1B:用反链引物进 行测序，以各种甲状腺癌细胞系和甲状腺癌的样品测试，显示TERT启动子突变G228A和 G250A的反链DNA。图1A和1B:WR0细胞系用来显示野生型人TERT启动子。PTC，甲状腺乳头状 癌;FTC，甲状腺滤泡状癌;ATC，甲状腺未分化癌;PDTC，低分化甲状腺癌。
[0027]图2. TERT启动子在膀胱癌和胶质母细胞瘤的突变。也显示了野生型TERT启动子。 样本代表性地显示膀胱癌和成胶质细胞瘤代表电泳测序和两个TERT启动子突变。该图的上 部显示了野生型DNA的正链序列和两个突变在这两种癌症的核苷酸变化的电泳测序图。该 图的下部显示了野生型DNA的反链序列和两个突变在这两种癌症的核苷酸变化的电泳测序 图。
【具体实施方式】
[0028] 可以理解的是，本发明并不限于所述的具体方法和内容等，因本文中所描述是可 以变化。也应当理解，本文使用的术语仅用于描述具体实施方案的目的，并不限制本发明的 范围。必须指出，如