专利名称：抑制人端粒酶反转录酶基因表达的siRNA和表达载体及其在制药中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种siRNA，特别是涉及一种靶向抑制人端粒酶反转录酶基因表达的siRNA和表达载体及其在制药中的应用。
背景技术：
目前抑制致癌基因表达的肿瘤基因治疗方法主要是用反义寡核苷酸技术(Agraival，Trends in Biotech，1992，10152)阻断有害基因的表达，其作用机理已经清楚，它通过碱基互补配对与双链DNA形成三链，或与RNA形成杂交双链，从而阻断基因的复制、转录、转录后加工或翻译。它也可以激发RNaseH活力，降解RNA、DNA杂交双链中的RNA链或以其它的方式最终阻断基因的表达。人们使用反义寡核苷酸技术抑制某些基因的过度表达。但由于反义寡核苷酸技术没有放大效应，一般用量均较大，在细胞转染研究中有些使用达2μmol以上，抑制基因表达效果大约在50％-90％左右，对一些受体和特殊蛋白的抑制作用仅有10-20％。在临床试用的一些反义寡核苷酸，如Bcl-2癌基因的反义寡核苷酸剂量达4.1mg/m2到73.6mg/m2(Webb A，Lancet 1997，3491137)。这样靶向作用癌细胞的效率就大大降低。也限制了反义寡核苷酸技术的广泛应用。
端粒酶的表达水平与恶性肿瘤的发生、发展和预后密切相关，因此已成为新的肿瘤标志物和肿瘤治疗靶点。已有研究报道用端粒酶反义寡核苷酸治疗多种肿瘤(Teng L et al.J Clin Endocrinol Metab 2003，881362；Schindler A et al.IntJ Oncol 2001，1925；张素珍等，Chinese J of Cancer，2002，21493；王孝养等，中华内科杂志，2002，413；许宁等，中华泌尿外科杂志，2000，216)，有一定的治疗效果。他们利用端粒酶反义寡核苷酸分别作用于甲状腺癌、前列腺癌、鼻咽癌、肺癌、肾癌细胞，都能不同程度抑制癌细胞端粒酶的活性及癌细胞的增殖，缺点是所用剂量较大，抑制效果仍不能达到要求。
最近RNA干涉(RNA interference，RNAi)技术的应用给癌症的基因治疗带来新的应用前景。国际上最早是1998年2月由Fire和Mello首次在《Nature》上发表了在一种线虫上应用了该技术，随后许多研究者在果蝇、植物和动物卵细胞上进行了大量研究，结果表明RNAi现象在上述生物体内都能发生。直到2001年5月和2001年12月，德国科学家Elabshir、Harborth和Tuschl等人在《Nature》和《J.Cell Sci.》上相继发表了用RNAi技术分别使哺乳类细胞中16个基因表达水平降低或沉默，从而证明RNAi对哺乳类细胞也是有影响的，这使得这项技术应用于治疗某些由于特定基因表达过多引起的疾病(如癌基因的过度表达引起的癌症)成为可能。有望此项技术能成为新的癌症基因治疗的有效手段。这种技术可使靶向的mRNA表达在短时间内明显降低，并且具有放大瀑布式效应，使靶向基因在较长时间内表达持续降低，所用剂量小，抑制效果高。
发明内容
本发明的目的是提供一种靶向抑制人端粒酶反转录酶(human telomerasereverse transcriptase，hTRT)基因mRNA表达的siRNA。
本发明的另一个目的是提供一种能表达上述siRNA的质粒载体。
本发明还有一个目的是提供上述siRNA及其表达质粒载体在制备治疗或预防肿瘤的药物中的应用。
本发明的目的可以通过以下措施来达到本发明的原理是通过构建一种质粒载体(命名为psiRNATE)，这种质粒载体能产生19-23个核苷酸的小双链RNA(siRNA)，该siRNA与hTRT mRNA存在互补关系，能靶向识别hTRT mRNA上与其互补的序列，并能与之结合，从而影响端粒酶基因表达的活性。
据此设计，首先在基因库中寻找靶向基因hTRT的mRNA序列，并从起始密码后75个碱基开始寻找AA+N19+UU序列或AA+N19序列(N19为任意19个mRNA核苷酸序列)，然后计算所选择的19-23 nts mRNA碱基序列中G+C比例在30％到70％之间，再将19-23 nts mRNA序列用Blast搜寻EST基因库，确认所靶向的基因是唯一的，再设计19-23个核苷酸的反义RNA，并用SiACE-RNAi方法合成二条RNA链，形成一种特异性抑制人端粒酶反转录酶基因表达的小双链RNA，它包含下列四种小双链RNA中的任意一种或几种，它们的碱基序列见表1。
表1小双链RNA序列及靶向作用人端粒酶反转录酶基因部位(序列号AF015950)
本发明的目的还可以通过下列措施实现一种能抑制人端粒酶反转录酶基因表达的小双链RNA的表达质粒系列，它具有以下的基本结构由启动子、小双链RNA编码区和DNA序列顺序连结而成的环状双链DNA分子，其中启动子为任何真核基因的启动子，它是启动它下游的小双链DNA表达成小双链RNA表达元件；小双链RNA编码区是由能表达表1中的小双链RNA序列的双链DNA构成主体的双链DNA，并在细胞内表达形成双向或发夹结构的小双链RNA；DNA序列为任何真核质粒在启动子、编码区之外的DNA序列，含有抗生素抗性基因，包括使细菌获得针对某种抗生素的抗性基因或使真核细胞获得针对某种抗生素的抗性基因。
所述的小双链RNA在制备治疗和预防肿瘤的药物中的应用。
所述的质粒在制备治疗和预防肿瘤的药物中的应用。
本发明的优点将表1中的双链RNA(siRNA)二链的3’末端延伸合成2-5个dT序列，以减少细胞内降解，并将合成的小双链RNA转染细胞，以确认这些小双链RNA能特异性靶向抑制端粒酶反转录酶基因表达，然后将这些小双链RNA通过双向或发夹结构相对应的双链DNA克隆到质粒载体中，使这种质粒能在细胞内转录形成3’末端延伸2-5个U同表1相同序列的双链RNA。
将上述能形成表1相同双链序列的双链RNA(siRNA)的表达质粒载体psiRNATE用脂质体包裹分别转染或通过病毒载体直接感染Hela宫颈癌细胞、SMMC7721肝癌细胞、MKN-45胃癌细胞，建立稳定的转psiRNA载体的细胞株。与对照组(未转染的癌细胞株)相比，用western法检测上述转psiRNATE质粒细胞株中hTRT的含量，结果表明(具体数据见实施例)本发明psiRNATE质粒载体能明显抑制上述几种癌细胞中hTRT的活性。进一步测定转染癌细胞株中的端粒酶活性，结果明显低于未转染质粒癌细胞组。将各种转染的细胞株分别接种到含有移植瘤的裸鼠体内，观察瘤体生长情况，结果表明该质粒能有效地抑制瘤体的生长。构建的能产生小双链RNA的质粒载体及该小双链RNA，能靶向作用于hTRT mRNA，抑制癌细胞中端粒酶的活性，并能在整体动物实验中抑制移植瘤的生长，其抑制效应比端粒酶反义寡核苷酸的效应更明显，持续时间更久。表明该发明可应用于制备治疗和预防肿瘤的药物。
图1空载体pcDNA3.1(+)图谱图21.5％琼脂糖凝胶电泳U6+1+antisense DNA条带图31.5％琼脂糖凝胶电泳U6+1+sense DNA条带图41.5％琼脂糖凝胶电泳U6+1+antisense和U6+1+sense条带图5Hela细胞转染psiRNATE对端粒酶基因表达蛋白的抑制图6psiRNATE转染Hela细胞、SMMC7721细胞、MKN-45细胞对端粒酶活性的影响图7裸鼠接种Hela细胞25天后瘤体生长体积图8pRK5空质粒载体图谱图9Hela细胞转染psiRNA-TRT对端粒酶基因表达蛋白的抑制图10psiRNA-TRT转染Hela细胞、SMMC7721细胞、MKN-45细胞对端粒酶活性的影响图11裸鼠接种Hela细胞25后瘤体生长体积具体实施方式
通过下列的实施例对本发明作进一步阐述，但并不限制本发明的范围。
实施例1构建由正义链(sense链)和反义链(antisense链)形成的双向小双链RNA表达载体抑制端粒酶反转录酶基因表达。
1.小双链RNA表达载体的构建(1)包涵目的基因的双链DNA的形成为了将设计好的小双链RNA序列(以SEQ ID NO.1为例)能在质粒中表达出来，首先合成3个引物，利用PCR技术形成相应的分别包涵U6+1启动子的双链DNA片段。3个引物的序列分别是3’末端正义链(sense)引物序列为5’-ATT GGG CCC GTC GAC ATC GAT AAA AAA GAA GCC GAA GGC CAG CACGTT CGG TGT TTC GTC CTT TCC AC-3’(SEQ ID NO.5)3’末端反义链(antisense)引物序列为5’-CCG GAA TCC TCT AGA AAA AAA GAA CGT GCT GGC CTT CGG CTT CGGTGT TTC GTC CTT TCC AC-3’(SEQ ID NO.6)5’末端引物序列为5’-ATA AGA ATG CGG CCG CCC CGG GGA TCC AAG GTC GGG-3’(SEQ ID NO.7)分别将3’末端的正链和负链引物与5’末端引物通过PCR扩增形成两条DNA双链(sense链、antisense链)，PCR模板为pTZU6+1，PCR的过程94℃ 1分钟，57℃ 1分钟，72℃ 1分钟，35个循环后，72℃ 10分钟，4℃保存。
(2)酶切包涵目的基因U6+1+antisense的双链DNA及质粒载体pcDNA3.1(5.428kb)PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳，紫外光下在350bp左右有一条很深很亮的条带，是U6+1+antisense DNA条带，用Qiagen凝胶回收试剂盒回收。取17μl回收的含U6+1+antisense DNA，加10×限制性内切酶XbaI缓冲液2μl，再加入限制性内切酶XbaI1μl，混匀，37℃酶切过夜，再在反应体系中加限制性内切酶BamHI 1μl，37℃酶切3h。同样的方法用XbaI和BamHI酶切空质粒载体pcDNA3.1(5.428kb)。电泳并回收，得到含U6+1+antisense小片段DNA(酶切位点为XbaI和BamHI)以及大片段质粒载体pcDNA3.1(酶切位点为XbaI和BamHI)。-20℃保存备用。
(3)酶切包涵目的基因U6+1+sense的双链DNA及空质粒载体pcDNA3.1PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳，紫外光下在350bp左右有一条很深很亮的条带，是U6+1+sense DNA条带，用Qiagen凝胶回收试剂盒回收。取17μl回收的含U6+1+senseDNA，加10×限制性内切酶NotI缓冲液2μl，再加入限制性内切酶NotI 1μl，混匀，37℃酶切过夜，然后反应体系中加入16μl 4M醋酸铵溶液，84μl无水乙醇，混合，-20℃ 30分钟，14000g 4℃ 15分钟离心，去上清，吹干后，加入17μl无菌水和10×限制性内切酶ApaI，酶切3h。同样的方法用NotI和ApaI酶切空质粒载体pcDNA3.1(5.428kb，图谱见图1)。得到含U6+1+sense小片段DNA(酶切位点为NotI和ApaI和)以及大片段质粒载体pcDNA3.1(酶切位点为NotI和ApaI)。-20℃保存备用。
(4)将目的基因U6+1+antisense连接到质粒载体pcDNA3.1中取酶切大片段质粒载体pcDNA3.1(酶切位点为XbaI和BamHI)1μl，再取U6+1+antisense小片段DNA(酶切位点为XbaI和BamHI)7μl，加入10μl的无菌水，2μl的10×T4 DNA连接酶缓冲液和1μl的T4 DNA连接酶，22℃孵育1小时。在孵育液中加入100μl的感受态大肠杆菌DH5α，转化大肠杆菌，然后涂布在含100μg/ml氨苄青霉素的LB固体培养基上，37℃过夜培养16-18h，随机挑取菌落于含100μg/ml氨苄青霉素的液体LB培养基中扩增细菌，抽提质粒，分别用限制性内切酶XbaI和BamHI酶切鉴定，反应液在1.5％琼脂糖凝胶电泳分离，结果见图2，图中2、3、4、5、6、7为含有U6+1+antisenseDNA片断的阳性克隆菌。选择出现350bp插入片段的质粒，保存备用。
(5)将目的基因U6+1+sense连接到质粒载体pcDNA3.1中取酶切大片段质粒载体pcDNA3.1(酶切位点为NotI和ApaI)1μl，再取U6+1+sense小片段DNA(酶切位点为NotI和ApaI)7μl，加入10μl的无菌水，2μl的10×T4 DNA连接酶缓冲液和1μl的T4 DNA连接酶，22℃孵育1小时。在孵育液中加入100μl的感受态大肠杆菌DH5a，转化大肠杆菌，然后涂布在含100μg/ml氨苄青霉素的LB固体培养基上，37℃过夜培养16-18h，随机挑取菌落于含100μg/ml氨苄青霉素的液体LB培养基中扩增细菌，抽提质粒，分别用限制性内切酶NotI和ApaI酶切鉴定，反应液在1.5％琼脂糖凝胶电泳分离，结果见图3，图中1、2、3、6为含有U6+1+sense DNA片断的阳性克隆菌。出现350bp插入片段的质粒，保存备用。
(6)将步骤(4)中的阳性克隆菌提质粒，并用Apa I酶切3h后，在反应液中加0.5μl平头酶，37℃孵育15min，75℃灭活10min，然后反应体系中加入16μl 4M醋酸铵溶液，84μl无水乙醇，沉淀，离心。去上清，吹干后，加入17μl无菌水和10×限制性内切酶HindIII缓冲液和1μl HindIII，酶切3h。1.5％琼脂糖凝胶电泳分离，得到350bp的含U6+1+antisense小片段DNA，其酶切位点为HindIII和Apa I(平)。胶回收备用。
(7)将步骤(5)中的阳性克隆菌提质粒，并用EcoR I酶切2h后，在反应液中加0.5μl平头酶，37℃孵育15min，75℃灭活10min，然后反应体系中加入16μl 4M醋酸铵溶液，84μl无水乙醇，沉淀，离心。去上清，吹干后，加入17μl无菌水和10×限制性内切酶HindIII缓冲液和1μl HindIII，酶切3h。1.5％琼脂糖凝胶电泳分离，得到包含U6+1+sense的大片段，其酶切位点为HindIII和EcoRI(平)。胶回收备用。
(8)psiRNATE质粒的构建取步骤(7)中的包含U6+1+sense的大片段1μl，再取步骤(6)中的U6+1+antisense小片段DNA(酶切位点为XbaI和BamHI)7μl，按步骤(4)中的连接方法将小片段介入大片段中。转化大肠杆菌，然后涂布在含100μg/ml氨苄青霉素的LB固体培养基上，37℃过夜培养16-18h，随机挑取菌落于含100μg/ml氨苄青霉素的液体LB培养基中扩增细菌，抽提质粒，分别用限制性内切酶BamHI酶切鉴定，1.5％琼脂糖凝胶电泳U6+1+antisense和U6+1+sense条带分离，出现350bp片段的为阳性克隆菌，结果见图4，图中1号为包含U6+1+antisense和U6+1+sense片断的阳性克隆菌。对阳性克隆菌测序，结果表明新构建的质粒载体中包含U6+1+antisense和U6+1+sense，其质粒命名为psiRNATE。
阳性克隆菌的测序结果5′-CTGGCTAGCGTTTAAACTTAAGCAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCAAGGCGGGCAGGAAGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTAGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGAAGCCGAAGGCCAGCACGTTCTTTTTTTCTAGAGATTCTGCAGATATCCAGCACAGTGGCGGCCGCCCCGGGGATCCAAGGTCGGGCAGGAAGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTAGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGGAACGTGCTGGCCTTCGGCTTCTTTTTATCGATGTCNANGGGCCCGTNNAACCCNCTGTNCNNCCTCNACTGGGCCTNCTAANTTGNCCNCANNCGGNGGTNGCCCTCCCCNNN-3′(SEQ ID NO.8)其中包含两段U6+1启动子序列(41-309)(381-650)5′-GGATCCAAGGTCGGGCAGGAAGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTAGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCG-3′(SEQ ID NO.9)
和antisense链序列(311-330)5′-GCCGAAGGCCAGCACGTTC-3′(SEQ ID NO.10)以及sense链序列(651-670)5′-GAACGTGCTGGCCTTCGGC-3′(SEQ ID NO.11)。
2、基因转染和细胞培养将宫颈癌Hela细胞，在含有10％小牛血清的RPMI1640培养液、37℃、5％CO2、饱和湿度环境的条件下连续培养。转染前一天，将3.0×105对数期生长的上述三种细胞接种于6孔培养板，1.5×105个细胞/孔，过夜培养后，细胞的贴壁率在40％左右时，吸去培养液，用不含青霉素、链霉素和小牛血清的1640洗1次。接下来取psiRNATE质粒4μg，加入250μl Opti-MEM混合稀释，另一试管加入10μl lipofectamin 2000，用250μl Opti-MEM混合稀释。两试管在室温无菌条件下放置5分钟，两试管合并混合后室温无菌条件下放置20分钟，待溶液变稠后移入6孔板中，每孔加入560μl培养介质，37℃5％CO2下培养4小时，每孔再加入含2倍小牛血清和2倍青霉素、链霉素的1640培养液1440μl，37℃5％CO2下培养72h后再用G418 250μg/ml筛选。每2-3天换一次液，最终挑选出阳性细胞克隆。扩增培养。
3.用western blot法检测hTRT在上述Hela细胞中的表达将上述转psiRNATE质粒的宫颈癌Hela细胞培养，加1％SDS裂解液消化，收集细胞。超声破碎细胞。聚丙烯酰胺凝胶电泳，转硝酸纤维素膜，剪下目的蛋白条带。用1％脱脂奶粉封闭30min，按1∶200加入兔抗hTRT多克隆抗体一抗，37℃孵育2h，1％脱脂奶粉洗3次，再按1∶50加入二抗(山羊抗兔IgG-HRP，购自华美生物工程公司)，37℃孵育2h，1％脱脂奶粉洗5次，0.05M Tris-HCl pH7.4洗一次。用DAB(二氧基联苯胺)浓缩液按1∶50稀释液显色。结果见图5，图中1为正常Hela细胞组，2为转染空白质粒组，3为转染psiRNATE组。结果表明，转染psiRNATE质粒的Hela宫颈癌细胞中的hTRT明显减少。
4.端粒酶活性测定分别在Hela宫颈癌细胞、SMMC7721肝癌细胞、MKN-45胃癌细胞中转染psiRNATE质粒，温育3d，PBS溶液洗1次，4℃ 1000r/min离心1min，沉淀加入150μl洗涤缓冲液(10mmol/L HEPES-KOH，pH7.5，1.5mmol/L MgCl2，10mmol/L KCl，1mmol/L DTT)洗涤，离心1min，弃洗液，加50μl裂解缓冲液(10mmol/L Tris-HCl pH7.5，1mmol/L MgCl2，1mmol/L EGTA，0.1mmol/L PMSF， 5mmol/L巯基乙醇，0.5％CHAPS，10％甘油。)，悬浮，混匀，置冰浴30min，4℃14000r/min离心20min，取上清2μl做TRAP反应模板。取反应管，各加入45μl反应混合物，加入2μl已处理的标本，混匀，加入30μl液体石蜡，至25℃水浴保温30min，在PCR仪上循环，94℃ 120s；94℃ 30s；48℃ 30s；72℃ 92s；72℃300s循环35次。循环结束后，在微孔板各孔中加入杂交反应液，再加入扩增产物20μl混匀，设立空白对照，至37℃恒温反应60min，然后加入显色剂，37℃避光显色10min，加入反应终止液(200mmol/L EDTA，20mmol/L Tris-HCl pH7.0)，终止反应。在波长570-630nm读取A值，结果见图6，图中1为Hela细胞对照组；2为SMMC7721细胞对照组；3为MKN-45细胞对照组；4为Hela-psiRNATE细胞组；5为SMMC7721-psiRNATE细胞组；6为MKN-45-psiRNATE细胞组。结果表明转染psiRNATE质粒的Hela宫颈癌细胞、SMMC7721肝癌细胞、MKN-45胃癌细胞端粒酶活性明显受到抑制。
5.动物致瘤性实验将BALB/C(nu/nu)裸小鼠随机分成对照组、转空白质粒组和转psiRNATE质粒组，每组6只，均为雌性。取对数生长期的Hela宫颈癌细胞，0.25％胰酶消化后置于无血清1640培养液中，调整浓度为5×107/ml，分别接种于BALB/C(nu/nu)裸小鼠的右腋皮下，每只0.1ml，待形成肉眼可见肿瘤后，隔日用游标卡尺测量肿瘤的长(L)和宽(W)，肿瘤体积按下列公式计算V＝(L×W7)×0.52。各组均在注射肿瘤细胞25天后，颈椎脱臼处死裸鼠，剖出肿瘤，测量肿瘤体积大小。结果见图7，图中1为对照组，2为转空白质粒组，3为转染psiRNATE组。结果显示对照组在接种裸鼠后14天内就形成肉眼可见肿瘤，第25天时肿瘤平均体积为498mm3，转空白质粒组肿瘤平均体积为474mm3而转psiRNATE质粒组在裸鼠体内形成肿瘤速度明显较慢，在肿瘤细胞接种后25天肿瘤平均体积为37.2mm3。表明psiRNATE质粒可明显抑制肿瘤的生长，可用于制备治疗肿瘤的药物。
实施例2.构建发夹状小双链RNA表达载体抑制hTRT基因表达U6启动子能高效表达小双链RNA，但一般的质粒载体中不存在这一启动子，因此首先需要构建这种启动子。
1.U6+1启动子的构建(1)U6+1启动子PCR引物的设计和PCR的过程引物3’端引物AATCTGCAGAAAAAGCGGACCGAAGTCCGCTCTAGATGCATGCTCGAGGTCGTCCGGTGTTTCGTCCTTTC
CAC(SEQ ID NO.12)5’端引物CGCGGATCCAAGGTCGGGCAGGAAGAGGGC(SEQ ID NO.13)PCR模板pTZU6+1PCR的过程94℃ 1分钟，57℃ 1分钟，72℃ 1分钟，35个循环后，72℃ 10分钟，4℃保存。
(2)PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，紫外光下在280bp有一条很深很亮的条带，这就是U6+1启动子的条带，切下，用Qiagen凝胶回收试剂盒回收凝胶上的双链DNA，取17μl回收的DNA，加10×限制性内切酶PstI缓冲液2μl，再加入限制性内切酶PstI 1μl，混匀，37℃保温酶解5小时，反应后，反应体系中加入16μl 4M醋酸铵溶液，84μl无水乙醇，混合，20℃30分钟，14000g 4℃ 15分钟离心，去上清，吹干后，加入17μl无菌水和10×限制性内切酶BamHI缓冲液2μl，再加入限制性内切酶BamHI 1μl，混合，37℃保温酶解2小时。最后，1％琼脂糖凝胶电泳，紫外光下在280bp有一条很深很亮的条带，切下，用Qiagen凝胶回收试剂盒回收凝胶上的双链DNA，溶解于20μl无菌水中，是为A液，-20℃保存备用。
2.pRK5空质粒载体的酶切和与U6+1启动子的连接(1)取空质粒载体pRK5(4716bp，图谱见图8)0.5μg(0.5μl)，加10×限制性内切酶PstI缓冲液2μl，无菌水17μl和限制性内切酶PstI 1μl，混匀，37℃保温酶解5小时，反应后，反应体系中加入16μl 4M醋酸铵溶液，84μl无水乙醇，混合，-20℃30分钟，14000g 4℃ 15分钟离心，去上清，吹干后，加入17μl无菌水和10×限制性内切酶BamHI缓冲液2μl，再加入限制性内切酶BamHI 1μl，混合，37℃保温酶解2小时。最后，1％琼脂糖凝胶电泳，紫外光下在4500bp上方有一条带，切下，用Qiagen凝胶回收试剂盒回收凝胶上的双链DNA，溶解于20μl无菌水中，是为B液，-20℃保存备用。
(2)取上述的A液7μl，B液1μl，加入10μl的无菌水，2μl的10×T4 DNA连接酶缓冲液和1μl的T4 DNA连接酶，22℃孵育1小时。
(3)在孵育液中加入100μl的感受态大肠杆菌DH5a，转化大肠杆菌，然后涂布在100μg/ml氨苄青霉素的LB固体培养基上，37℃过夜培养16-18小时，随机挑取菌落于含100μg/ml氨苄青霉素的液体LB培养基中扩增细菌，抽提质粒，分别用限制性内切酶PstI和BamHI酶切，反应液在1％琼脂糖凝胶电泳分离，选择出现350bp插入片段的质粒，保存备用。
3.抑制hTRT基因表达的发夹状小双链RNA的制备和连接本发明所提供的发夹状双链RNA(siRNA)，与hTRT基因(序列号AF015950)的部分双链序列相同(位点在340-358)，但在双链一侧加了9个核苷酸序列的环，此环的序列为TTCAAGAGA。增加此环的目的是提高小双链RNA的表达量。
siRNA抑制hTRT mRNA的作用位点见表1，这些RNA序列必须符合以下原则从基因序列中的起始密码后75个碱基开始寻找AA+N19+UU序列或AA+N19序列，其中N19任意19个mRNA核苷酸序列。一般从中找出21个核苷酸中G+C比例为50％左右，并不高于70％或不低于30％的核苷酸。将符合要求的21个碱基序列在NCBI database中通过BLAST搜索小核苷酸序列同源性和EST Library，以保证所靶向的目的基因是唯一的。按设计好的21个碱基的sense RNA和antisense RNA的3’端用2-4个dT或2-6个U修饰，可减少细胞内降解。
发明人根据以上原则，设计合成了表1中的NO.2序列(SEQ ID NO.2)，序列为5’-CGU GCU GGC CUU CGG CUU C-3’3’-GCA CGA CCG GAA GCC GAA G-5’作用于hTRT mRNA的第340-358位点。
两端留下SalI和XbaI的酶切位点，具体的发夹状RNA的基因序列为N端5’-GATCCGAACGTGCTGGCCTTCGGCTTCAAGAGAGCCGAAGGCCAGCACGTTCTTTTTTGGAAA-3’(SEQ ID NO.14)C端5’-AGCTTTTCCAAAAAAGAACGTGCTGGCCTTCGGCTCTCTTGAAGCCGAAGGCCAGCACGTTCG-3’(SEQ ID NO.15)(1)把分别合成的上述两条单链DNA配成双链把配成50μM的单链DNA各取2μl，加入46μl的annealing Buffer(100mM醋酸钾，30mM Hepes-KOH pH7.4，2mM醋酸镁)，在PCR仪中，95℃ 4分钟，70℃ 10分钟，关机后冷却至室温，4℃存放后，-20℃保存备用。
(2)合成双链DNA的磷酸化2μl合成双链DNA1μl T4多聚核苷酸激酶的缓冲液A1μl 1mM ATP1μl T4 PNK5μl无菌水把总体积为10μl的液体混匀，37℃ 30min，70℃ 10min，然后冷却至室温，4℃存放后，-20℃保存备用。
(3)取已经连接上U6启动子的pRK5质粒16μl(1μg)，加10×限制性内切酶SalI缓冲液2μl，限制性内切酶SalI和XbaI各1μl，混匀，37℃保温酶解5h，反应后，1％琼脂糖凝胶电泳，紫外光下在5000bp下方有一条带，切下，用Qiagen凝胶回收试剂盒回收凝胶上的双链DNA，溶解于20μl无菌水中，-20℃保存备用。
(4)将上述酶切的质粒1μl和上述磷酸化的合成的双链DNA 7μl，加入10μl的无菌水，2μl的10×T4 DNA连接酶缓冲液和1μl的T4 DNA连接酶，22℃孵育1h。
(5)在孵育液中加入100μl的感受态大肠杆菌DH5α，转化大肠杆菌，然后涂布在100μg/ml氨苄青霉素的LB固体培养基上，37℃过夜培养16-18h，随机挑取菌落于含100μg/ml氨苄青霉素的液体LB培养基中扩增细菌，抽提质粒，分别用限制性内切酶SalI和XbaI酶切，反应液在2.5％琼脂糖凝胶电泳分离，出现64bp插入片段的为阳性克隆菌，将其质粒命名为pRTRT。
4.含G418抗性基因双链RNA质粒psiRNA-TRT的构建方法(1)把已经构建好的pRTRT质粒，取17μl(约1μg)，加10×限制性内切酶EcoRI缓冲液2μl，限制性内切酶EcoRI 1μl，混匀，37℃保温酶解1小时，反应后，反应体系中加入16μl 4M醋酸铵溶液，84μl无水乙醇，混合，-20℃30分钟，14000g 4℃ 15分钟离心，去上清，吹干后，加入17μl无菌水和10×限制性内切酶XbaI缓冲液2μl，再加入限制性内切酶XbaI 1μl，混合，37℃保温酶解5小时。最后，1％琼脂糖凝胶电泳，紫外光下在400bp有一条带，切下，用Qiagen凝胶回收试剂盒回收凝胶上的双链DNA，溶解于20μl无菌水中，是为A液，-20℃保存备用。
(2)取pcDNA3.1质粒17μl(约1μg)，加10×限制性内切酶EcoRI缓冲液2μl，限制性内切酶EcoRI 1μl，混匀，37℃保温酶解2小时，反应后，反应体系中加入16μl4M醋酸铵溶液，84μl无水乙醇，混合，-20℃30分钟，14000g 4℃ 15分钟离心，去上清，吹干后，加入17μl无菌水和10×限制性内切酶XbaI缓冲液2μl，再加入限制性内切酶XbaI 1μl，混合，37℃保温酶解5小时。最后，1％琼脂糖凝胶电泳，紫外光下在5400bp有一条带，切下，用Qiagen凝胶回收试剂盒回收凝胶上的双链DNA，溶解于20μl无菌水中，是为B液，-20℃保存备用。
(3)质粒的连接、转化和鉴定取上述的A液7μl，B液1μl，加入10μl的无菌水，2μl的10×T4 DNA连接酶缓冲液和1μl的T4 DNA连接酶，22℃孵育1小时。
在孵育液中加入100μl的感受态大肠杆菌DH5α，转化大肠杆菌，然后涂布在100μg/ml氨苄青霉素的LB固体培养基上，37℃过夜培养18小时，随机挑取菌落于含100μg/ml氨苄青霉素的液体LB培养基中扩增细菌，抽提质粒，分别用限制性内切酶EcoRI和XbaI酶切，反应液在1％琼脂糖凝胶电泳分离，选择出现400bp插入片段的质粒为阳性克隆菌，其质粒命名为psiRNA-TRT。
5.psiRNA-TRT质粒对Hela细胞hTRT基因表达的抑制作用(1)Hela细胞的培养和转染Hela细胞来自上海中科院细胞所，1640培养基+10％小牛血清培养，待培养到细胞的贴壁率在80％左右，铺6孔细胞培养板，1.5×105个细胞/孔，过夜培养后，细胞的贴壁率在40％左右时，吸去培养液，用不含青霉素、链霉素和小牛血清的1640洗1次。接下来取p siRNA-TRT质粒4μg，加入250μl Opti-MEM混合稀释，另一试管加入10μl lipofectamin2000，用250μl Opti-MEM混合稀释。两试管在室温无菌条件下放置5分钟，两试管合并混合后室温无菌条件下放置20分钟，待溶液变稠后移入6孔板中，每孔加入560μl培养介质，37℃ 5％ CO2下培养4小时，每孔再加入含2倍小牛血清和2倍青霉素、链霉素的1640培养液1440μl，37℃5％CO2下培养72小时。
(2)细胞的筛选吸去培养介质，用含100μg/ml G418的1640培养基筛选阳性细胞，中间不断更换新鲜的含100μg/ml G418的1640培养基，待细胞完全贴壁后，此即为含有p siRNA-TRT质粒的Hela细胞。
(3)细胞的回收和抑制效果的鉴定把含有psiRNA-TRT质粒的Hela细胞在不含G418的1640培养基培养72h后，吸去培养介质，用Hank’s液洗一次，每孔加入50μl 1％SDS，取出细胞后，轻微超声粉碎细胞10秒，-70℃冻存。同时取出3μl用Bio-Rad DC测蛋白浓度，OD750测吸收值，从标准曲线查出蛋白浓度。调节蛋白浓度使每个样品的蛋白量为100μg作10％SDS-PAGE电泳，并转印到硝酸纤维素膜上，进行western法检测。含有样品的硝酸纤维素膜用2％脱脂奶粉配制的PBS(0.1M，pH7.0)洗30min，用鼠单抗(鼠抗hTRT单克隆抗体，下同)按1∶250用2％脱脂奶粉-PBS稀释后，振荡反应1.5小时，用2％脱脂奶粉-PBS洗30min。然后用HRP-山羊抗兔二抗(山羊抗兔IgG-HRP)1∶1000 2％脱脂奶粉-PBS稀释后反应1小时，PBS洗30min，DAB试剂盒显色处理，结果见图9，图中1为正常Hela细胞组，2为转染空白质粒组，3为转染psiRNA-TRT组。结果发现，与对照组比较，转染有psiRNA-TRT质粒的细胞中其抑制hTRT基因的表达在90％以上。
6.端粒酶活性测定将转染psiRNA-TRT质粒的Hela细胞温育3d，PBS溶液洗1次，4℃1000r/min离心1min，沉淀加入150μl洗液洗涤，离心1min，弃洗液，加50μl裂解液，悬浮，混匀，置冰浴30min，4℃14000r/min离心20min，取上清2μl做TRAP反应模板。取反应管，各加入45μl反应混合物，加入2μl已处理的标本，混匀，加入30μl液体石蜡，至25℃水浴保温30min，在PCR仪上循环，94℃ 120s；94℃ 30s；48℃ 30s；72℃ 92s；72℃ 300s循环35次。循环结束后，在微孔板各孔中加入杂交反应液，在加入扩增产物20μl混匀，设立空白对照，至37℃恒温反应60min，然后加入显色剂，37℃避光显色10min，加入终止液，终止反应。在波长570-630nm读取A值，结果见图10，图中1为Hela细胞对照组；2为SMMC7721细胞对照组；3为MKN-45细胞对照组；4为Hela-psiRNA-TRT细胞组；5为SMMC7721-psiRNA-TRT细胞组；6为MKN-45-psiRNA-TRT细胞组。结果表明转染psiRNA-TRT质粒的Hela细胞的端粒酶活性明显受到抑制。
7.动物致瘤性实验将BALB/C(nu/nu)裸小鼠随机分成转空白质粒组和转psiRNA-TRT质粒质粒组，每组6只，均为雌性。取对数生长期的空白质粒Hela细胞、以及转psiRNA-TRT质粒的Hela-psiRNA-TRT，0.25％胰酶消化后置于无血清1640培养液中，调整浓度为5×107/ml，分别接种于BALB/C(nu/nu)裸小鼠的右腋皮下，每只0.1ml，待形成肉眼可见肿瘤后，隔日用游标卡尺测量肿瘤的长(L)和宽(W)，肿瘤体积按下列公式计算V＝(L×W7)×0.52。各组均在注射肿瘤细胞22天后，颈椎脱臼处死裸鼠，剖出肿瘤，测量肿瘤体积大小，结果见图11，图中1为对照组，2为转空白质粒组，3为转psiRNA-TRT组。结果显示对照组Hela宫颈癌细胞在接种裸鼠后14天内就形成肉眼可见肿瘤，第25天时肿瘤平均体积为456mm3，转空白质粒组第25天肿瘤平均体积为437mm3而Hela-psiRNA-TRT细胞在裸鼠体内形成肿瘤速度明显较慢，在肿瘤细胞接种后25天肿瘤平均体积为19mm3。
序 列 表<110>徐根兴<120>抑制人端粒酶反转录酶基因表达的siRNA和表达载体及其在制药中的应用<160>15<210>1<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的小双链RNA<400>1gaacgugcug gccuucggc19<210>2<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的小双链RNA<400>2cgugcuggcc uucggcuuc19
<210>3<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的小双链RNA<400>3cacggugacc gacgcacug19<210>4<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的小双链RNA<400>4ggcgucuggg augcgaacg19<210>5<211>68<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述双向作用的双链RNA 3’端正义链引物序列<400>5attgggcccg tcgacatcga taaaaaagaa gccgaaggcc agcacgttcg gtgtttcgtc 60ctttccac 68<210>6<211>62<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述双向作用的双链RNA 3’端反义链引物序列<400>6ccggaatcct ctagaaaaaa agaacgtgct ggccttcggc ttcggtgttt cgtcctttcc 60ac62<210>7<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述双向作用的双链RNA 5’端引物序列<400>7ataagaatgc ggccgccccg gggatccaag gtcggg 36
<210>8<211>764<212>DNA<213>含有psiRNATE质粒的大肠杆菌序列<220>
<221>misc_signal<222>(686，688，697，698，704，709，711，712，717，727，732，736，739，742，743，747，751，761，762，763)<223>n＝a或g或c或t<400>8ctggctagcg tttaaactta agcagcttgg taccgagctc ggatccaagg cgggcaggaa 60gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 120ataattagaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 180aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 240atgcttacgt aacttgaaag tatttcgatt tcttggcttt atatatcttg tggaaaggac 300gaaacaccga agccgaaggc cagcacgttc tttttttcta gagattctgc agatatccag 360cacagtggcg gccgccccgg ggatccaagg tcgggcagga agagggccta tttcccatga 420ttccttcata tttgcatata cgatacaagg ctgttagaga gataattaga attaatttga 480ctgtaaacac aaagatatta gtacaaaata cgtgacgtag aaagtaataa tttcttgggt 540agtttgcagt tttaaaatta tgtttaaaat ggactatcat atgcttaccg taacttgaaa 600gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga cgaaacaccg gaacgtgctg 660gccttcggct tctttttatc gatgtcnang ggcccgtnna acccnctgtn cnncctcnac 720tgggcctnct aant tgnccn canncggngg tngccctccc cnnn 764<210>9<211>271
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述U6+1启动子序列<400>9ggatccaagg tcgggcagga agagggccta tttcccatga ttccttcata tttgcatata 60cgatacaagg ctgttagaga gataattaga attaatttga ctgtaaacac aaagatatta 120gtacaaaata cgtgacgtag aaagtaataa tttcttgggt agtttgcagt tttaaaatta 180tgttttaaaa tggactatca tatgcttacc gtaacttgaa agtatttcga tttcttggct 240ttatatatct tgtggaaagg acgaaacacc g271<210>10<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述构建的DNA双链的antisense链序列<400>10gccgaaggcc agcacgttc 19<210>11<211>19<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述构建的DNA双链的sense链序列<400>11gaacgtgctg gccttcggc19<210>12<211>74<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述U6启动子PCR 3’端引物<400>12aatctgcaga aaaagcggac cgaagtccgc tctagatgca tgctcgaggt cgtccggtgt 60ttcgtccttt ccac 74<210>13<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述U6启动子PCR 5’端引物<400>13cgcggatcca aggtcgggca ggaagagggc30
<210>14<211>63<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述单链DNA的N端<400>14gatccgaacg tgctggcctt cggcttcaag agagccgaag gccagcacgt tcttttttgg 60aaa63<210>15<211>65<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述单链DNA的C端<400>15agcttttcca aaaaagaacg tgctggcctt cggctctctt gaagccgaag gccagcacgt 60tcg 6权利要求
1.一种特异性抑制人端粒酶反转录酶基因表达的小双链RNA，其特征在于它包含下列四种小双链RNA中的任意一种或几种，它们的碱基序列如下a.5’-GAA CGU GCU GGC CUU CGG C-3’3’-CUU GCA CGA CCG GAA GCC G-5’b.5’-CGU GCU GGC CUU CGG CUU C-3’3’-GCA CGA CCG GAA GCC GAA G-5’c.5’-CAC GGU GAC CGA CGC ACU G-3’3’-GUG CCA CUG GCU GCG UGA C-5’d.5’-GGC GUC UGG GAU GCG AAC G-3’3’-CCG CAG ACC CUA CGC UUG C-5’
2.一种能抑制人端粒酶反转录酶基因表达的小双链RNA表达质粒系列，其特征在于它具有以下的基本结构由启动子、小双链RNA编码区和DNA序列顺序连结而成的环状双链DNA分子，其中启动子为任何真核基因的启动子，它是启动它下游的小双链DNA表达成小双链RNA表达元件；小双链RNA编码区是由能表达权利要求1所述的小双链RNA序列的双链DNA构成主体的双链DNA，并在细胞内表达形成双向或发夹结构的小双链RNA；DNA序列为任何真核质粒在启动子、编码区之外的DNA序列，含有抗生素抗性基因，包括使细菌获得针对某种抗生素的抗性基因或使真核细胞获得针对某种抗生素的抗性基因。
3.权利要求1所述的小双链RNA在制备治疗或预防肿瘤的药物中的应用。
4.权利要求2所述的质粒在制备治疗或预防肿瘤的药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种特异性抑制人端粒酶反转录酶基因表达的siRNA及该siRNA的表达质粒和它们在制备与人端粒酶活化有关的肿瘤的药物中的应用。本发明利用生物计算机信息技术从GenBank中获得一组人端粒酶反转录酶基因序列，并以RNA干扰技术为基础，设计出一组可能诱发RNA干扰的siRNA，通过化学法合成或质粒载体表达一定量的siRNA，从而特异性抑制人端粒酶反转录酶基因的表达。该siRNA及其表达质粒可制备高效快速、特异性强、副作用少的抗肿瘤药。
文档编号A61K48/00GK1580260SQ20031011734
公开日2005年2月16日 申请日期2003年12月11日 优先权日2003年8月7日
发明者郭丹, 刘文华, 肖祥华, 傅更锋, 樊燕蓉, 刘新卷, 徐根兴 申请人:徐根兴