专利名称：道地性金银花聚合酶链反应－限制性酶切图谱鉴定方法
技术领域：
本发明涉及中药材种质的品质鉴定技术领域。
本发明的技术方案如下首先从各药材中提取总DNA，利用一对引物，用PCR方法扩增一段DNA片段，经纯化后，对该片段进行DNA序列测定，建立各样品的DNA序列数据库，在比较数据库DNA序列的基础上，得到道地产区金银花的特征DNA碱基序列为5’-GCCCCCCCGC CCCGCCTCCCACAGGGTCGC G-3’，针对道地与非道地产区金银花DNA序列的差异，选择合适的DNA限制性内切酶酶切位点，通过分析聚合酶链反应产物的限制酶切图谱差异，达到快速、准确鉴别道地与非道地产区金银花的目的。对需要鉴定的金银花样品，提取其DNA，在给定的PCR条件下，用一对引物(LjP1、LjP2；TakaiwaF，Oono K，Sugiura M.Nucleotide sequence of the 17S-25S spacer region from ricerDNA.Plant Mol Biol，1985，4355-364)，供试品能够扩增出一段DNA片段；用限制性内切酶EcoN I或其同切酶对供试品的PCR扩增产物进行酶切后，通过琼脂糖凝胶电泳检测，将会出现708、461、247bp的条带，道地产区461bp的条带显著亮于或近等于708bp的条带，非道地产区708bp的条带显著亮于461bp的条带。当供试样品经用本法进行PCR扩增，并对PCR产物进行限制性内切酶酶切后，经琼脂糖凝胶电泳观察DNA片段的大小及亮度，便可准确地鉴定道地及非道地产区的金银花。本发明设计的用于鉴别道地产区金银花PCR-RFLP分子鉴定方法是采用以下步骤a、药材DNA的提取按常规进行，用无离子水将供试样品的DNA浓度调节至0.1～0.3μg/μl；b、扩增DNA片段，即进行聚合酶链反应，用于聚合酶链反应的一对引物的DNA序列为LjP15’-CGTAAC AAG GTT TCC GTA GGT GAA-3’LjP25’-TTATTG ATA TGC TTA AAC TCA GCG GG-3’c、PCR扩增产物中加入限制性内切酶EcoN I或其同切酶进行酶切，限制性内切酶EcoN I或其同切酶的酶切位点为CCTNN^NNNAGG；d、琼脂糖凝胶电泳分析；e、鉴定结果的判断，若461bp的条带显著亮于或近等于708bp的条带则供试品为道地产区的金银花，若708bp的条带显著亮于461bp的条带则供试品为非道地产区的金银花。
本发明的效果是可解决道地与非道地产区金银花的鉴定难题，提供鉴定所需的一对PCR引物、PCR反应条件、道地产区金银花的特征DNA碱基序列、一种限制性内切酶。与非道地金银花相比，道地性金银花所含的有效成分有明显差别，其药效强于非道地药材，因此市场上道地性金银花的价格高于非道地药材。然而，道地与非道地金银花难以通过形态、显微等特征来加以区别，因此，急需找到一种可靠的鉴别方法。本发明利用道地与非道地药材DNA序列的差异，建立了快速、便捷、可靠的PCR-RFLP鉴别方法，对于保证金银花的药材质量，打击假冒道地产区金银花的市场行为具有重要的价值。
(3)PCR产物的电泳检测取上述反应液4μl，与1μl载样缓冲液混合，用1.5％琼脂糖凝胶(含0.5μg/μl溴化乙锭，即EB)电泳检测扩增结果，各种DNA样品均能扩增出一条约708bp的DNA条带；b、聚合酶链反应产物的限制性内切酶酶切反应DNA限制性内切酶酶切反应反应液参考体积为20μl，其中各种物品的用量为PCR产物 10μl10×R+限制性内切酶缓冲液 2μl限制性内切酶EcoN I 2～5U无离子水补齐至 20μl将反应液置37℃保温3～4小时，反应结束后置于65℃水浴10分钟，使酶失活；d、电泳观察酶切结果酶切产物用2％琼脂糖凝胶(含0.5μg/μl的溴化乙锭，即EB)，在80V电压下电泳1～2小时，观察电泳结果；e、测定结果的判断，使用限制性内切酶EcoN I或其同切酶对聚合酶链反应扩增产物进行酶切，产生对道地与非道地产区金银花具有鉴别性特征的酶切DNA片段长度及条带亮度图谱。若供试品461bp的条带显著亮于或近等于708bp的条带则为道地产区的金银花，若708bp的条带显著亮于461bp的条带则为非道地产区的金银花，见附
图1。道地性金银花聚合酶链反应一限制性酶切图谱鉴定方法<110>中国药科大学<120>道地性金银花聚合酶链反应一限制性酶切图谱鉴定方法<160>1<210>1<211>31<212>DNA<213>金银花(Lonicera japonica Thunb.)<400>1gcccccccgc cccgcctccc acagggtcgc g
权利要求
1一种道地性金银花特有的DNA碱基序列，其特征在于DNA序列为5’-GCCCCCCCGC CCCGCCTCCC ACAGGGTCGC G-3’。
2一种道地性金银花聚合酶链反应-限制性酶切图谱，其特征在于能够识别道地产区金银花特有DNA碱基序列的限制性内切酶EcoN I及其同切酶对聚合酶链反应产物消化后的琼脂糖凝胶电泳的特征图谱。鉴定方法为(1)、药材DNA的提取按常规进行，用无离子水将供试样品的DNA浓度调节至0.1～0.3μg/μl；(2)、扩增DNA片段，即进行聚合酶链反应(PCR)，用于聚合酶链式反应的一对引物的DNA序列为LjP15’-CGT AAC AAG GTT TCC GTA GGT GAA-3’LjP25’-TTA TTG ATA TGC TTA AAC TCA GCG GG-3’(3)、PCR扩增产物中加入限制性内切酶EcoN I或其同切酶进行酶切，限制性内切酶EcoN I或其同切酶的酶切位点为CCTNN^NNNAGG；(4)、琼脂糖凝胶电泳分析；(5)、鉴定结果的判断若461bp的条带显著亮于或近等于708bp的条带则供试品为道地产区的金银花；若708bp的条带显著亮于461bp的条带则供试品为非道地产区的金银花。
全文摘要
本发明属于中药材种质的品质鉴定技术领域，目的是提供一种准确鉴别道地(河南、山东)与非道地(其他产区)产区金银花的聚合酶链反应－限制性酶切图谱分子鉴定方法(PCR－RFLP)。道地产区金银花的特征DNA碱基序列为5′－GCCCCCCCGC CCCGCCTCCC ACAGGGTCGC G－3’；限制性内切酶EcoNI及其同切酶可识别并切割该序列。鉴定过程如下提取药材DNA用一对引物进行PCR扩增；用限制性内切酶EcoNI或其同切酶消化PCR产物；琼脂糖凝胶电泳分析结果；通过与道地性金银花PCR─RFLP特征结果相比较，即可判断供试品是否为道地性金银花药材。
文档编号C07H21/04GK1438235SQ0311300
公开日2003年8月27日 申请日期2003年3月20日 优先权日2003年3月20日
发明者李萍, 王冲之, 周开亚 申请人:中国药科大学