专利名称：实时荧光定量rt－pcr检测人细胞角蛋白19试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属生物技术领域，为一种通过逆转录(RT)mRNA样品得到cDNA，再结合实时荧光定量PCR检测技术，可以精确定量检测标本中人细胞角蛋白19(CK19)的mRNA表达量的试剂盒。
血道转移是肿瘤扩散的主要途径之一，因此在患者外周血中进行肿瘤细胞基因表达检测、肿瘤特异性标记产物检测是了解肿瘤转移情况的一个有效的方式，因此肿瘤标记物(tumormarker)的检测对肿瘤形成及转移的诊断具有极大的帮助。但是在肿瘤转移发生的早期，外周血中的肿瘤细胞常常很少，无法完全依赖病理形态检查，同时肿瘤特异性抗原的含量也很少，也很难通过常用的酶标免疫吸附分析(ELISA)或放射免疫分析(RIA)等方法检测到，因此，对循环血中的微量肿瘤细胞基因表达和一些特异性产物检测的研究，已经引起了人们的广泛关注。
目前肿瘤发病率和死亡率居高不下，某些恶性肿瘤还有上升的趋势。如能对肿瘤转移患者早期发现，对进一步治疗方案的制定有非常重要的意义，是提高肿瘤的治愈率重要途径之一。对我国医疗卫生事业的发展有极重要的社会意义与经济意义。因此，我们致力于开发恶性肿瘤转移早期检测及诊断技术，以解决临床治疗的一大难题。
随着分子生物学技术的飞速发展及其在医学研究中的广泛应用，通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测外周血中微量肿瘤细胞已成为可能并被尝试。RT-PCR有着比病理学或ELISA/RIA等方法无法比拟的高灵敏度及相对的高特异性，为外周血中微量肿瘤细胞的检测带来了希望，但在高灵敏度、高特异性的背后也隐藏着一些无法避免的假阳性问题，因此也在某种程度上阻碍了这一高新技术在临床检测中的推广应用。
CK19是上皮细胞特异性表达基因产物，在正常人外周血等组织细胞中无CK19 mRNA的表达。因此检测患者外周血、淋巴结、骨髓等标本中有无CK19 mRNA的表达，可以对上皮类来源肿瘤的转移诊断和治疗提供有力证据，还可以对肿瘤的转移和复发情况以及疗效观察提供帮助。以往对CK19 mRNA的检测采用的是定性RT-PCR法，但从技术角度来讲，定性PCR虽然从灵敏度比传统的ELISA等方法有了明显提高，但其特异性相对较差，且无法精确定量。TaqMan荧光定量PCR技术及相应检测仪器的推出使得人们可以在利用PCR高灵敏性的情况下，对PCR产物进行实时精确定量检测，不仅解决了PCR的定量问题，而且还大大提高了检测的特异性。
发明内容
本发明试剂盒包含RT反应液、M-MLV逆转录酶、Rnasin、PCR反应液、Taq、标准品、对照品。
其中RT反应液的成份含有DEPC-H2O、MMLV-RT缓冲液、Oligo(dT)15-18、dNTPs。
其中PCR反应液的成份含有PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、检测用引物、探针。
检测用引物分上游引物和下游引物上游引物序列为5′-GCAGAACCGGAAGGATGCT-3′，下游引物序列为5′-TCCGTTTCTGCCAGTGTGTC-3′荧光探针序列为5′-FAM-AGGTCGCTGGCCACACGGAGC-TAMRA-3′标准品序列为GAAGGCCTGA AGGAAGAGCT GGCCTACCTG AAGAAGAACC ATGAGGAGGA AATCAGTACGCTGAGGGGCC AAGTGGGAGG CCAGGTCAGT GTGGAGGTGG ATTCCGCTCC GGGCACCGATCTCGCCAAGA TCCTGAGTGA CATGCGAAGC CAATATGAGG TCATGGCCGA GCAGAACCGGAAGGATGCTG AAGCCTGGTT CACCAGCCGG ACTGAAGAAT TGAACCGGGA GGTCGCTGGCCACACGGAGC AGCTCCAGAT GAGCAGGTCC GAGGTTACTG ACCTGCGGCG CACCCTTCAGGGTCTTGAGA TTGAGCTGCA GTCACAGCTG AGCATGAAAG CTGCCTTGGA AGACACACTGGCAGAAACGG AGGCGCGCTT TGGAGCCCAG CTGGCGCATA TCCAGGCGCT GATCAGCGGTATTGAAGCCC AGCTGGGCGA TGTGCGAGCT GATAGTGAGC GGCAGAATCA GGAGTACCAGCGGCTCATGG ACATCAAGTC GCG对照品分为阳性对照和阴性对照，阴性对照为无CK19 mRNA的RNA样品，阳性对照为有CK19mRNA的RNA样品。
本试剂盒保存于-20℃，尽量减少反复冻融。
本发明建立了利用TaqMan技术检测CK19表达的方法，并经检测患者标本，表明该方法切实可行。由于本方法采用了PCR扩增技术，使得CK19表达的检测敏感性大大提高，而且由于荧光探针的应用，使得其特异性亦大大提高，降低了常规PCR扩增的假阳性率，使得我们可以在极少的标本中获得足够的信息。本方法所设计的引物、探针以及检测结果，可以为荧光定量PCR检测试剂盒的开发提供可靠的依据。
在本检测项目中，我们采用了目前最先进的特异性荧光探针杂交定量PCR检测技术，在保持高敏感性的前提下尽量减少假阳性干扰。在实时荧光定量PCR检测技术出现之前，人们对PCR模板的定量不论是直接PCR还是竞争性PCR，基本上都要通过PCR产物电泳，再将电泳结果经计算机图像处理，根据电泳条带的亮度来确定最终PCR产物量的多少，或将带标记的PCR产物以ELISA的方式进行检测，再由此推测起始模板的量，但这些方法实际上都属于半定量水平，因为即使PCR条件已最优化，电泳及后续步骤的操作的不稳定性仍会给结果分析带来影响，从而影响定量这一目的。随着实时荧光定量PCR技术的出现，人们可以真正地做到对PCR模板的精确定量，这种定量不仅保持了常规PCR的高灵敏性，而且由于特异性荧光探针杂交技术的应用，使得被检测基因的特异性大大提高。
本发明试剂盒使用方法每次检测均应设立阳性对照和阴性对照。标准品用无菌去离子水稀释为1×102-1×109拷贝/ml。
逆转录总体积25μl，其中2μl 70℃预变性5分钟的待测RNA，20.75μl RT反应液，1.0μl M-MLV逆转录酶，1.25μl Rnasin。于37℃水浴反应10-15分钟。
扩增检测在荧光定量PCR仪上进行，总体积50μl，其中47.0μl PCR反应液，2.5μl检测样品(逆转录产物、标准品、阳性或阴性对照)，0.5μl Taq DNA聚合酶。反应条件95℃预变性5分钟，95℃30秒、62℃15秒、75℃15秒共40个循环，72℃延伸10分钟，置4℃。根据所获得的标准曲线，计算得到各待测标本中CK19的量(拷贝数/ml)。
图2为实时荧光定量RT-PCR标准曲线。
实施例1荧光定量RT-PCR法检测CK19的表达一、材料Trizol试剂及限制性内切酶均购自美国LTI/Gibco公司，pGEM-T-Easy克隆系统、MMLV逆转录酶、Taq DNA聚合酶、Oligo(dT)15-18购自美国Promega公司，测序试剂、377型测序仪、2400型PCR仪及7700型定量PCR仪均为美国Perkin Elmer公司产品。
二、引物及探针设计与合成以CK19全长cDNA序列(GenBank登录号M17303)为模板，使用Primer ExpressTM(V1.0，美国Perkin Elmer公司)软件分析TaqMan引物和探针位点，并根据同时考虑CK19基因组DNA序列情况，从中选择最佳组合。
标准品PCR上游引物序列为5′-GAAGGCCTGAAGGAAGAGCTG-3′；下游引物为5′-CGCGACTTGATGTCCATGAG-3′；检测用PCR上游引物序列为5′-GCAGAACCGGAAGGATGCT-3′；下游引物序列为5′-TCCGTTTCTGCCAGTGTGTC-3′，均由上海生工公司合成。
荧光探针序列为5′-FAM-AGGTCGCTGGCCACACGGAGC-TAMRA-3′，由大连宝生物技术公司合成。
三、检测标准品制备患者的新鲜手术标本立即液氮冻存，并于液氮存在下于研钵中磨碎后用Trizol试剂提取总RNA，取1μl RNA，在25μl总反应体积内用oligo(dT)15-18为引物对其进行逆转录后，用标准品上下游引物在2400型PCR仪上进行PCR扩增，条件为95℃5分钟变性，95℃30秒、62℃30秒、72℃30秒进行30个循环扩增，最后于72℃延伸10分钟后置4℃。
PCR产物经电泳检测后即用克隆系统插入pCR2.1克隆载体，并将阳性克隆经测序验证。EcoRI酶切后回收503bp片段，即为标准品。测定浓度并换算成(拷贝数/体积)。
实施例2一、标本检测7例经病理确诊的恶性肿瘤患者外周血标本，分离外周血有核细胞，经PBS洗涤后，离心收集细胞用Trizol试剂提取细胞总RNA，取1μgRNA，在25μl总反应体积内用oligo(dT)15-18为引物对其进行逆转录后，用检测用上下游引物在PE公司7700型定量PCR仪上进行PCR扩增，条件为95℃5分钟变性，95℃30秒、62℃30秒、72℃30秒进行40个循环扩增，最后于72℃延伸10分钟后置4℃。同时加标准品检测作标准曲线。测定结果经仪器处理根据标准曲线计算出检测标本的CK19表达量。
二、结果(一)标准品的制备经测序，上述设计标准品完全与预期相符，回收的标准品片段序列如下(包括两端EcoRI位点)
GAATTCGAAGGCCTGA AGGAAGAGCT GGCCTACCTG AAGAAGAACC ATGAGGAGGA AATCAGTACGCTGAGGGGCC AAGTGGGAGG CCAGGTCAGT GTGGAGGTGG ATTCCGCTCC GGGCACCGATCTCGCCAAGA TCCTGAGTGA CATGCGAAGC CAATATGAGG TCATGGCCGA GCAGAACCGGAAGGATGCTG AAGCCTGGTT CACCAGCCGG ACTGAAGAAT TGAACCGGGA GGTCGCTGGCCACACGGAGC AGCTCCAGAT GAGCAGGTCC GAGGTTACTG ACCTGCGGCG CACCCTTCAGGGTCTTGAGA TTGAGCTGCA GTCACAGCTG AGCATGAAAG CTGCCTTGGA AGACACACTGGCAGAAACGG AGGCGCGCTT TGGAGCCCAG CTGGCGCATA TCCAGGCGCT GATCAGCGGTATTGAAGCCC AGCTGGGCGA TGTGCGAGCT GATAGTGAGC GGCAGAATCA GGAGTACCAGCGGCTCATGG ACATCAAGTC GCGGAATTC(二)样品检测标准品检测结果参见
图1，标准曲线参见图27例患者外周血标本检测结果如下患者编号 性别 年龄 标本 CK19值(拷贝数/ml)1 男77外周血5×1032 女43外周血1.9×1043 男65外周血9×1034 女45外周血8.8×1025 男65外周血1.0×1036 男59外周血7.0×1027 男56外周血9.4×102本发明是结合最佳实施例进行描述的，然而在阅读了本发明的上述内容后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1.一种实时荧光定量RT-PCR检测人细胞角蛋白19试剂盒，其特征是它含有RT反应液、M-MLV逆转录酶、Rnasin、PCR反应液、Taq、标准品、对照品。
2.如权利要求1所述的实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征是RT反应液包含DEPC-H2O、RT缓冲液、Oligo(dT)15-18、dNTPs。
3.如权利要求1所述的实时荧光定量RT-PCR检测人细胞角蛋白19试剂盒，其特征是PCR反应液包含PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、上下游引物、探针。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征是上下游引物序列分别是5′-GCAGAACCGGAAGGATGCT-3′和5′-TCCGTTTCTGCCAGTGTGTC-3′。
5.如权利要求3所述的试剂盒，其特征是探针为荧光探针，其序列为5′-FAM-AGGTCGCTGGCCACACGGAGC-TAMRA-3′。
6.如权利要求1所述的试剂盒，其特征是标准品序列为GAAGGCCTGA AGGAAGAGCT GGCCTACCTG AAGAAGAACC ATGAGGAGGA AATCAGTACGCTGAGGGGCC AAGTGGGAGG CCAGGTCAGT GTGGAGGTGG ATTCCGCTCC GGGCACCGATCTCGCCAAGA TCCTGAGTGA CATGCGAAGC CAATATGAGG TCATGGCCGA GCAGAACCGGAAGGATGCTG AAGCCTGGTT CACCAGCCGG ACTGAAGAAT TGAACCGGGA GGTCGCTGGCCACACGGAGC AGCTCCAGAT GAGCAGGTCC GAGGTTACTG ACCTGCGGCG CACCCTTCAGGGTCTTGAGA TTGAGCTGCA GTCACAGCTG AGCATGAAAG CTGCCTTGGA AGACACACTGGCAGAAACGG AGGCGCGCTT TGGAGCCCAG CTGGCGCATA TCCAGGCGCT GATCAGCGGTATTGAAGCCC AGCTGGGCGA TGTGCGAGCT GATAGTGAGC GGCAGAATCA GGAGTACCAGCGGCTCATGG ACATCAAGTC GCG
7.如权利要求1所述的试剂盒，其特征是对照品分为阴性对照和阳性对照，阴性对照为无CK19 mRNA的RNA样品，阳性对照为有CK19 mRNA的RNA样品。
8.如权利要求1所述的试剂盒，其特征是利用该试剂盒所设计的引物及探针进行的PCR/RT-PCR进行CK19 mRNA的定性和定量检测。
全文摘要
本发明为一种实时荧光定量RT－PCR检测人细胞角蛋白19试剂盒，该试剂盒通过逆转录(RT)mRNA样品得到cDNA，再结合实时荧光定量PCR检测技术，可以精确定量检测标本中CK19的mRNA表达量。该试剂盒可以用于临床及科研中检测患者的外周血及淋巴结、骨髓等标本中CK19的表达，用以辅助诊断、指导治疗及提示预后。
文档编号G01N21/64GK1410761SQ0214528
公开日2003年4月16日 申请日期2002年11月12日 优先权日2002年11月12日
发明者张行, 曹江, 叶景佳, 郑树 申请人:浙江大学医学院附属第二医院