应用唯一引物的聚合酶链式反应方法及其应用的制作方法

专利名称：应用唯一引物的聚合酶链式反应方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学技术，特别是涉及聚合酶链式反应的方法。
背景技术：
PCR是一种简单、专一、灵敏、快速的基因扩增方法。PCR的基本原理和方法是根据已知的基因顺序设计一对引物(primer-pair)，其中，正引物(forward-primer)在模板顺序的上游与模板DNA双链中的反链顺序互补，而反引物(reverse-primer)在模板顺序的下游与模板DNA双链中的正链顺序互补。模板DNA在高温下变性解开成单链，当降至退火温度范围时正引物和反引物分别与模板的反链和正链结合，然后DNA聚合酶从引物与模板结合的部位的3’端按5’至3’的方向使链延伸，从而完成一个循环的扩增。十几年来经典PCR都是按此原理来设计一对引物。
根据PCR方法的基本原理设计一对具有高严谨性的、与目标基因顺序完全互补的引物是扩增成功的关键因素。但是，十几年来的研究和应用实践也表明一对与模板顺序完全匹配的引物既不是完成扩增的充分条件，也不是完成扩增的必要条件。PCR反应体系中的模板DNA通常是人基因组DNA或互补DNA，不仅其总的碱基顺序高达几十亿而且在变性后解开成单链至退火温度的过程中其立体结构十分复杂，空间位阻可能影响DNA聚合酶对引物与模板退火部位的接触。即使在适宜的反应条件下用一对高严谨性的与模板顺序完全匹配的引物，也不一定能专一地扩增目标产物，有时甚至得不到目标扩增产物。另一方面，用与基因顺序有错配甚至是较严重错配的引物也往往能完成扩增甚至专一地得到目标扩增产物而无非专一扩增产物干扰。这些事实提示使用一对引物不应是PCR引物的唯一模式。应用与模板顺序上下游均有较高匹配但不完全匹配的唯一一个引物，有可能完成目标产物的扩增甚至得到专一的目标产物。
以往文献中曾出现若干标题或摘要含关键字“单一引物”(single-primer)的研究报告，追踪文献的原文表明这些研究实际上均仍采用一对引物而不是一个引物。这些报告中的一部分使用所谓“单一引物”只是强调他们应用了“一对引物”(single-primer-pair)而不是用应用几对引物的多重PCR(Multiplex)。另一些则是先用一个基因专一的一个引物(gene-specific-single-primer)进行反转录，然后再用另一对引物进行PCR，就PCR而言仍是使用一对引物。还有一些称为是单一引物PCR的报告实际上是一种不对称PCR技术，它先用一对引物进行扩增，然后利用正反引物的浓度或引物的解链温度的区别在扩增进行到一定阶段后，使其中一个引物停止作用，而另一个引物(single-primer)继续作用从而可得到单链DNA产物。总之，至今尚无研究报告尝试并成功地应用唯一一个引物对一段顺序已知的核酸进行扩增并得到专一的目标产物。
本发明的唯一引物使用一条引物DNA链或称寡核苷酸完成PCR扩增，其英文意义为unique primer，所进行的反应为唯一引物PCR即unique primer PCR。

发明内容
本发明所要解决的技术问题本发明提供使用唯一引物来完成PCR或RT-PCR的方法及其应用，以突破经典PCR理论中必须使用一对引物完成扩增的技术常规，避免了标准PCR由于正反引物对模板DNA链的结合效率有所不同可能造成的对扩增效率的负面影响，也避免了正反引物间的3’端碱基的互补。
发明构思本发明基于两点事实和构想。第一，对于一个长约20碱基的引物，如果它的3’端数起的前6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个或更多的碱基与模板顺序完全匹配，而其他碱基与模板顺序有一个、多个或完全错配时，该引物与模板的结合效率仍可能达到作为一个引物甚至是非常高严谨性引物的要求。第二，在每一个基因的几百至几千碱基长的顺序范围内都可能存在一对或几对长为6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个或更多碱基的寡核苷酸片段，他们的顺序是呈反向互补的。这两点说明用一个引物来专一地扩增目标产物是现实的。
下面用随机选择的基因顺序的测试分析结果来说明上述构想，帮助理解本发明的构思。
1.引物结合效率主要取决于3’端碱基顺序的匹配。
引物与模板的结合效率高低是引物严谨性高低的重要标志之一，引物结合效率取决于整个引物的长度，碱基组成和排列，但主要取决于引物的3’端碱基的组成和排列。为了对上述定论有一个量化的认识，我们从人肌动球蛋白基因(基因库编号BC016045)中随机选取5个长为20碱基的寡核苷酸，用引物设计软件Oligo6.0来测试计算当在引物的不同位置发生与模板有连续三个G与C或A与T置换的错配时引物的结合效率，测试值和统计结果示于表1。
表1.错配碱基位置对引物结合效率的影响


*以无错配时的引物结合效率为100％表1说明错配碱基对结合效率的影响与其位置有密切关系。发生在5’端的错配对结合效率影响甚小，当错配发生在距3’端10个碱基左右时错配对结合效率的影响开始陡然增加，结合效率由70％左右突降至40％左右。
2.长度为8、9和10个碱基的寡核苷酸的结合效率。
从人肌动球蛋白基因(基因库编号BC016045)随机选取长度为8、9和10个碱基的寡核苷各21个，用Oligo6.0计算它们的结合效率，统计结果示于表2。
表2.寡核苷酸的结合效率


引物设计软件Oligo6.0对引物结合效率按引物严谨性高低分成6挡(表3)。
表3.不同严谨性引物的结合效率指标

根据表1和表2并参照表3可以推断如果一个引物的3’端的6-12个或更多的核苷酸与模板顺序完全互补，而在其他位置为完全错配，有多个错配时或个别错配时，该引物的结合效率可能超过290甚至超过360，符合作为唯一引物或高严谨性引物的基本要求。
3.反相互补顺序出现的频率。
从宏观看每一个寡核苷酸顺序的出现频率是随机的。任何一个指定的寡核苷酸顺序平均每隔4n个核苷酸出现一次，n代表寡核核苷酸的碱基数。假定一个目标PCR扩增产物的长度为1000碱基，则一个指定的寡核苷酸顺序在目标扩增产物内重复出现的机会是1000/4n。如果不指定寡核苷酸的顺序，则在1000碱基内出现任何一个种重复顺序寡核苷酸的可能有1000/(1000/4n)个。表4显示了重复出现6-12个碱基长寡核苷酸顺序的频率的计算结果。
表4.寡核苷酸顺序出现频率

表4结果说明在一个1000左右碱基的核酸顺序内，有不同程度的机会出现6-12个碱基长的重复顺序。根据随机性原则在一段核酸顺序内出现寡核苷酸重复顺序和出现寡核苷酸反相互补顺序的几率是一样的。换言之，在一个1000左右碱基的核酸顺序内，有不同程度的机会出现6-12碱基长呈反向互补的寡核苷酸。如果将这种核苷酸顺序作为引物的3’端，再根据模板顺序从寡核苷酸的5’端延伸若干碱基并加以个别调整，就可得到一个引物分别在模板的上下游与反和正链有较高的匹配，用此引物可扩增目标产物。
技术方案本发明的聚合酶链式反应方法，其反应过程依次包括如下步骤(1)模板变性；(2)引物与模板退火；(3)DNA聚合酶催化下延伸合成互补DNA链；(4)按步骤(1)-(3)循环进行扩增反应。
且在整个反应过程中的引物为唯一的根据模板DNA链顺序特征而设计的一条寡聚核苷酸链，针对模板DNA序列进行扩增。所说引物的3’端的6-20个核苷酸与模板顺序完全互补优选6-12个核苷酸与模板顺序完全互补，最优为8-10个核苷酸完全互补。
2-5个上述的PCR反应方法在反应条件统一的条件下组合成多重PCR，相应地，在反应体系中有2-5条引物分别对不同DNA模板序列同时进行PCR。
上述的聚合酶链式反应方法作为其他PCR反应的内参照反应，其唯一引物设计于在基因组中拷贝数相对恒定的持家基因序列，将唯一引物加入其他PCR反应体系中同时扩增，以内参照反应的产物量为参比校正其他PCR产物量，避免管与管之间因加入的模板量和扩增效率不同而导致的误差。
本发明的一种逆转录聚合酶链式反应方法，其反应过程依次包括如下步骤
(1)DNA引物为引导、以RNA链为模板、以逆转录酶催化合成DNA模板；(2)模板变性；(3)引物与模板退火；(4)DNA聚合酶催化下延伸合成互补DNA链；(5)按步骤(2)-(4)循环进行扩增反应。
且在整个反应过程中的引物为唯一的根据模板DNA链顺序特征而设计的一条寡聚核苷酸链，此寡核苷酸链既作为逆转录反应的引物，又作为PCR反应的引物。引物的3’端的6-15个核苷酸与模板顺序完全互补。
2-5个上述的RT-PCR反应方法在反应条件统一的条件下组合成多重RT-PCR，相应地，在反应体系中有2-5条引物分别对不同RNA模板序列同时进行RT-PCR。
上述的逆转录聚合酶链式反应作为其他RT-PCR反应的内参照反应，其唯一引物设计于在基因组中拷贝数相对恒定的持家基因序列，将唯一引物加入其他RT-PCR反应体系中同时扩增，以内参照反应的产物量为参比校正其他PCR产物量，避免管与管之间因加入的模板量和扩增效率不同而导致的误差。
利用上述的所有聚合酶链式反应方法或逆转录聚合酶链式反应方法检测病原微生物，唯一引物的设计上考虑两个方面既要求唯一引物3’端序列与该病原微生物的保守序列互补，又要求5’端序列的全部或部分碱基与病原微生物的各种亚型株或变异株的相应碱基互补，以尽量减少检测过程中可能发生的假阴性。
关于唯一引物设计方法说明如下使用一对引物的标准PCR方法的引物设计既可完全用人工方法确定，又可完全依赖引物设计软件自动确定，也可二者结合在引物设计软件的辅助下由人工确定。但是，用人工方法来寻找唯一引物十分困难或几乎不可能。另一方面，现今市场和网络上的引物设计软件虽名目繁多但无一具有自动寻找重复顺序或反向互补顺序的功能。在新功能软件开发闻世之前需籍软件辅助用人工方法来确定。
第一步，首先人为地设定一个用于人工筛选的寡核苷酸长度例如25碱基。如果设定的长度较短搜寻颇费时间，反之，则漏筛的机会较高。第二步以Oligo6.0和设定测试长度为25碱基为例，将正引物的位置定在1-25、26-50、51-75、76-100......以此类推，逐一观察引物软件所显示的引物与DNA正链假性结合效率的图谱，从中找出有6-12个碱基呈反向互补顺序，将其作为候选寡核苷酸。由于出现6或7个碱基呈反向互补的机会较多，并且最终从中找到良好的唯一引物的机会较低，应优选考虑选择8-10个碱基呈反向互补的顺序。第三步将候选寡核苷酸作为约20碱基长引物的3’端，根据模板顺序延长并调节5’端的碱基使引物与上游模板顺序和下游模板顺序的结合效率和错配碱基数量尽可能接近或相同。在调整5’端碱基时也要考虑引物的3’端互补和发夹结构情况，使其尽可能符合通常引物的高严谨性要求。
有益效果1.应用唯一引物PCR只需要合成和制备一个引物，但可达到使用一对引物所达到的扩增效果。
2.应用唯一引物PCR在扩增的最初二个循环即形成扩增产物前，由于引物与正反链的结合效率不完全相同使之在扩增效率上可能有细微差别。但随后的扩增过程中引物与正反链的结合效率完全相同，避免了标准PCR应用一对引物时由于正反引物结合效率有所不同可能造成的对扩增效率的负面影响。
3.标准PCR方法应用一对引物来完成扩增，在引物设计时需要考虑避免正反引物间的3’端碱基的互补，因为正反引物间的3’端互补比引物自身互补更容易导致引物二聚物的形成。引物二聚物的形成既影响了扩增效率，也为用荧光试剂直接检测PCR产物设置了障碍，也影响了SYBRGreen实时荧光定量PCR的正确性和可靠性。应用唯一引物则大大减少或完全避免了引物二聚物的干扰。
4.引物自身的互补也会形成二聚物，但由于引物自身互补形成的二聚物的二侧顺序是互补的，会形成强发夹结构，因而实际上对扩增很少或完全没有影响。应用唯一引物扩增目标产物时引物浓度可比标准PCR通常所用引物浓度范围的上限还高一个数量级，这就有利于推迟PCR平坡的出现，有利于PCR反应产物累积直线期增长，为应用普通PCR仪和常规电泳技术作终点法定量PCR创造了必要条件。
5.应用唯一引物还可以以总RNA或mRNA为原始模板，用单管一步法RT-PCR技术来完成目标基因的扩增，减少了非专一产物形成的机会。
6.唯一引物PCR方法也可用于多重PCR，即每一个目标基因均用一个引物或其中一个基因用一个引物，使多重PCR反应体系中总的引物数量减少，降低或避免了引物间形成引物二聚物的机会。
7.在比较不同样品的基因定量表达时需用持家基因作为被测基因的内参照，应用唯一引物来扩增持家基因，既增加了持家基因扩增的稳定和重复性，又减少了持家基因引物与被测基因引物间产生干扰的机会。
8.应用唯一引物PCR时，引物与模板顺序完全匹配不是引物设计的最重要指标。唯一引物的3’端碱基是由模板顺序而确定的，但引物的5’端顺序是根据模板上下游顺序进行调节的有较高的轫柔性。对于变异性较高的模板顺序如病毒基因，在调节5’端碱基时可考虑到基因的变异性。唯一引物PCR的退火温度通常较低，用于病毒感染的检测时使假阴性结果降低。
具体实施例方式
实施例1.
人肌动球蛋白基因(1841碱基，基因库编号BC016045)普遍被用作持家基因，在基因表达定量分析和比较中作为参照模板。本实施例以此基因为例进行测试，找到几十个序列呈反相互补长度为6-12碱基的寡核苷酸序列，其中一部分能达到引物或高严谨性引物的要求。
表5和表6列出在人肌动球蛋白基因中找到的部分能作为唯一引物PCR方法的引物顺序，并分析其引物与模板上下游结合的部位、引物与模板的结合效率和引物的其他特性。
表5.在人肌动球蛋白基因中找到的部分唯一引物的顺序

*粗黑体字表示与模板顺序错配表6.人肌动球蛋白基因中找到的部分唯一引物的特性

表6显示在长1800碱基左右的基因中得到至少10个寡核苷酸可用于唯一引物PCR，他们与模板DNA的上下游部位的的结合效率都超过290，其中半数以上超过360，达到了对非常高严谨性引物所要求的指标。
实施例2.
以与实施例1相同的方法对另一个持家基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(1283碱基，NM_006959)进行唯一引物设计。表7和表8列出在此基因中找到的部分能作为唯一引物PCR方法的引物顺序，并分析其引物与模板上下游结合的部位、引物与模板的结合效率和引物的其他特性。
表7.人甘油醛-3-磷酸脱氢酶中找到的部分唯一引物的顺序

*粗黑体字表示与模板顺序错配表8.人甘油醛-3-磷酸脱氢酶中找到的部分唯一引物的特性

表8显示在长1300碱基左右基因中得到至少5个寡核苷酸可用于唯一引物PCR，他们与模板DNA的上下游部位的的结合效率都超过290，其中半数以上超过360达到了对非常高严谨性引物所要求的指标。
实施例3.
实施例3使用表7和表8中所列出的扩增人甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因所用的引物G2，G3或G4。每管PCR反应液体积为5微升，引物浓度为0.5μM，以互补DNA作为模板DNA，互补DNA由人组织总RNA用ClonTech公司的cDNA合成试剂盒以poly(dT)为反转录引物制备得到。反转录时人组织总RNA用量为每20微升反应液1微克，反转录完成后将反应体积用无离子水稀释至100微升备用。每100微升PCR反应液加上述经稀释的互补DNA10微升。PCR反应用ClonTech公司的Advantage2试剂盒。反应条件为首次变性95℃1分钟，循环变性95℃10秒钟，退火52-72℃1分钟，延伸72℃1分钟，收尾延伸72℃3分钟，反应共28循环。反应完成后经聚丙烯酰胺凝胶电泳和溴乙锭染色后，用图像分析仪观察和记录扩增产物条带。试验结果示于表9。
表9.实施例3的PCR试验结果


记号+多少带表目标扩增产物强度记号*多少代表非专一条带多少记号-表示无条带表9结果说明所试的三个唯一引物PCR均在十几度宽的退火温度范围内有效扩增目标产物。应用引物G4能在72℃左右退火温度下，应用G2和G3引物能在66℃左右退火温度下专一地扩增目标产物而无非专一产物形成。
实施例4.
实施例4使用表5和表6中所列扩增人肌动球蛋白基因的唯一引物A6。PCR反应液组成和反应条件与实施例3相同，试验结果示于表10。
表10.实施例4的PCR试验结果

表10说明应用唯一引物A6能在60-72℃左右的退火温度范围内专一地扩增目标基因而无非专一产物干扰。
实施例5.
实施例5应用唯一引物A6测试不同引物浓度下引物二聚物的形成。试验条件与实施例3相同，引物浓度从0.5μM至50μM，退火温度为65℃30秒钟。试验结果示于表11。
表11.实施例5的PCR试验结果

表11说明应用唯一引物A6进行PCR，在引物浓度为20μM，即比标准PCR通常引物浓度上限高20倍的情况下，仍能有效地扩增目标基因而无引物二聚物和非专一扩增产物形成。
实施例6.
实施例6应用唯一引物A6以单管一步法从人总RNA得到目标扩增产物。RT-PCR采用ClonTech公司的TITANIUM一步法RT-PCR试剂盒。反转录温度从35-55℃，反转录时间1小时。完成反转录后在95℃保温3分钟并立即转入PCR。PCR程序与实施例3相同，每管反应体积为10微升，退火为65℃30秒钟。试验结果示于表12。
表12.实施例6试验结果

各种教课书和各公司试剂盒推荐的反转录温度范围为42-50℃，温度太低或偏高对反转录和随后的PCR的专一性和效率有严重影响。表12说明应用唯一引物A6能够在比上述范围低得多和高得多的范围内用一步法完成RT…PCR得到目标PCR扩增产物，并且没有任何非专一产物和引物二聚物的干扰。
实施例7实施例7为2个目标基因的多重PCR，每一个目标基因都用唯一引物扩增，二个引物分别为人肌动球蛋白基因的唯一引物A6(其顺序和特性见表5和表6)和人甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的唯一引物G3(其顺序和特性见表7和表8)。二个引物间的3’端互补顺序碱基数和能量分别为2个碱基/每克分子-3.1千卡和3个碱基个碱基/每克分子-6.2千卡。试验条件与实施例3相同，退火温度为65℃1分钟。结果得到2条目标产物条带。
实施例8实施例8为以人甘油醛-3-磷酸脱氢酶的唯一引物G3(其顺序和特性见表7和表8)作持家基因来校正人Beta肾上腺素受体基因(基因库编号M15169)的RT-PCR测定。引物顺序和特性示于表13和表14。
表13.实施例8引物的顺序

表14.实施例8引物的特性

作为持家基因的唯一引物G3与BAR2正引物和反引物的3’端互补碱基数和能量千卡/克分子数，经测试分别为2/-3.1、2/-1.6、2/3.1和2/-1.6。这些数值小于Beta肾上腺素受体基因引物之间的数值，说明加入持家基因引物不增加引物二聚体形成机会，不会对目标基因的扩增带来干扰。比较不同样品的Beta肾上腺素受体基因表达时，每一管加G3引物和BAR2正反引物，唯一引物物浓度0.5μM，目标基因引物各0.25μM，退火70℃1分钟，反应循环25-28，其他试验条件与实施例3相同。结果得到目标基因和持家基因扩增条带，用持家基因条带强弱可校正测得的目标基因条带。
权利要求
1.一种聚合酶链式反应方法，依次包括如下步骤(1)模板变性；(2)引物与模板退火；(3)DNA聚合酶催化下延伸合成互补DNA链；(4)按步骤(1)-(3)循环进行扩增反应。其特征在于整个反应的引物为唯一的一条寡聚核苷酸链。
2.根据权利要求1所述的聚合酶链式反应方法，其特征在于引物的3’端的6-20个核苷酸与模板顺序完全互补。
3.根据权利要求1所述的聚合酶链式反应方法，其特征在于引物的3’端的6-12个核苷酸与模板顺序完全互补。
4.根据权利要求1所述的聚合酶链式反应方法，其特征在于引物的3’端的8-10个核苷酸与模板顺序完全互补。
5.一种聚合酶链式反应方法，依次包括如下步骤(1)以DNA引物为引导、以RNA链为模板、以逆转录酶催化合成DNA模板；(2)模板变性；(3)引物与模板退火；(4)DNA聚合酶催化下延伸合成互补DNA链；(5)按步骤(2)-(4)循环进行扩增反应。其特征在于整个反应的引物为唯一的一条寡聚核苷酸链。
6.根据权利要求5所述的聚合酶链式反应方法，其特征在于引物的3’端的6-15个核苷酸与模板顺序完全互补。
7.权利要求1所述的反应方法组合成的多重PCR方法，其特征在于反应体系中有2-5条引物分别对不同模板序列同时进行PCR。
8.权利要求5所述的反应方法组合成的多重RT-PCR方法，其特征在于反应体系中有2-5条引物分别对不同模板序列同时进行RT-PCR。
9.权利要求1-8中任一项所述的聚合酶链式反应方法作为其他反应的内参照反应，其特征在于应用唯一引物来扩增持家基因。
10.利用权利要求1-9中任一项所述的聚合酶链式反应方法检测病原微生物，其特征在于唯一引物3’端序列与保守序列互补，5’端序列的全部或部分碱基与病原微生物的各种亚型株或变异株的相应碱基互补。
全文摘要
本发明提供使用唯一引物来完成PCR或RT－PCR的方法及其应用，整个反应的引物为唯一的根据模板DNA链顺序特征而设计的寡聚核苷酸链，引物3'端6－12个碱基与模板顺序完全互补，而5'端则采用柔性设计。突破了经典PCR理论中使用一对引物完成扩增的技术常规，克服了由于正反引物对模板DNA链的结合效率有所不同可能造成的对扩增效率的负面影响，也完全避免了正反引物间的3'端碱基的互补。适合应用于人类和病原微生物基因的PCR或RT－PCR检测，也可用于多重RCP或RT－PCR反应以减少引物间的相互影响，或者作为其他PCR/RT－PCR的内参照反应，减少了一对引物作为内参照时的引物间影响和扩增效率差异，有助获得可靠的定量或半定量结果。
文档编号C12P19/34GK1548543SQ0311701
公开日2004年11月24日 申请日期2003年5月20日 优先权日2003年5月20日
发明者徐定邦, 朱德芬, 谢文凯, 徐文慧 申请人:徐定邦, 徐文慧