专利名称：南方菜豆花叶病毒的rt-lamp检测试剂盒及检测方法
技术领域：
本发明涉及南方菜豆花叶病毒的检测技术，具体涉及南方菜豆花叶病毒的RT-LAMP检测试剂盒及检测方法。
背景技术：
南方菜豆花叶病毒(5bwiA<9_/7 bean mosaic virus, SBMV)是南方菜豆花叶病毒属(5b66 ota>W5.)的典型成员，主要分布在美洲和非洲的温热带地区,法国和亚洲的印度也有报道，该病毒主要通过豆科作物的种子进行远距离传播。目前检测南方菜豆花叶病毒的方法主要包括血清学检测、逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术和实时荧光RT-PCR检测技术等。血清学方法需要制备血清，较为繁琐，且检测周期长，并因南方菜豆花叶病毒存在不同株系易导致漏检现象。RT-PCR技术需对PCR产物进行开盖处理，易发生交叉污染，造成假阳性现象。实时荧光RT-PCR技术需要昂贵的检测设备，检测成本较高，不适合基层和小型实验室推广使用。环介导等温扩增技术(Loop-mediatedisothermal amplification, LAMP)作为一种新颖的核酸扩增方法，同样具有检测速度快、操作简单和灵敏度高等优点；该技术依赖于能够识别靶序列上6个特异区域的引物和一种具有链置换特性的Bst DNA聚合酶，在等温条件下可高效、快速和特异地扩增靶序列。由于LAMP呈瀑布式扩增，因此其扩增效率非常高；同时，LAMP识别靶序列上的6 8个特异性位点，其特异性也很强；LAMP只在60°C 65°C进行恒温扩增，只要水浴锅即可，无需特殊的仪器，操作非常简单；而且LAMP的整个检测反应只需I h左右，检测周期非常短。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种检测速度快、操作简单、检测结果判断容易和灵敏度高的南方菜豆花叶病毒的RT-LAMP检测试剂盒；并提供了南方菜豆花叶病毒的RT-LAMP检测方法。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为:南方菜豆花叶病毒的RT-LAMP检测试剂盒，该检测试剂盒包括2 X反应缓冲液，浓度8 U/μ L的Bst DNA聚合酶液，浓度为20μΜ的内侧上游引物、内侧下游引物、外侧上游引物和外侧下游引物，钙黄绿素荧光染料(购自Eiken公司)，所述2Χ反应缓冲液与Bst DNA聚合酶液、内侧上游引物、内侧下游引物、外侧上游引物、外侧下游引物、钙黄绿素荧光染料的体积比为12.5:1:2:2:0.25:
0.25:1，所述内侧上游引物的核苷酸序列为5 ’ - CGCCAACAGC CGTTGTGAAA TCGTTGGACAGCTTGGCAAG A-3 ’，所述内侧下游引物的核苷酸序列为5 ’ - TGGTCCCGGC GAGGCTTATAAGCGTCCAGT ACTCACAGC-3，，所述外侧 上游引物的核苷酸序列为5’ - ACGGCCAATGCTATCACG-3’，所述外侧下游引物的核苷酸序列为5’ - GCAGTGGGCT CTATCAGTTG-3’。南方菜豆花叶病毒的RT-LAMP检测方法，其步骤如下:
a、总RNA提取:0.1 g检测样品经液氮处理后研碎成粉末状，用Trizol核酸提取试剂提取总RNA，得到样品总RNA ;具体提取方法依Trizol核酸提取试剂的说明书进行；
b,RT-LAMP扩增:RT-LAMP扩增反应体系为2 X反应缓冲液12.5 μ L，浓度8 U/ μ L的Bst DNA聚合酶液1.0 μ L，钙黄绿素荧光染料l.0yL，浓度为20 μ M的内侧上游引物和内侧下游引物各2.0 μ L，浓度为20 μ M的外侧上游引物和外侧下游引物各0.25 μ L，样品总RNA2.5 μ L，无RNase的水补至25 μ L，反应条件为恒温63°C的水浴锅中扩增I h，再95°C 2min，得到扩增产物；
C、判断:在自然光照条件下，肉眼观察扩增产物颜色，若扩增产物呈黄绿色，则样品感染南方菜豆花叶病毒，若扩增产物呈橙色，则样品中无南方菜豆花叶病毒。与现有技术相比，本发明的优点在于南方菜豆花叶病毒的RT-LAMP检测试剂盒及检测方法,检测试剂盒包括2X反应缓冲液、DNA聚合酶液、内侧上游引物、内侧下游引物、外侧上游引物、外侧下游引物、钙黄绿素荧光染料，检测方法通过样品总RNA提取，RT-LAMP扩增，就可以得到检测结果，整个检测反应1.5 h内即可完成，通过4条引物识别靶基因6段不同的序列，提高了检测的特异性，25 μ L体系中总RNA含量为2pg也能灵敏检测，其灵敏度比普通RT-PCR检测高10倍，且无需复杂的检测仪器和检测过程，反应结束后在自然光照条件下裸眼观察扩增产物颜色变化，判定结果，不需进行后处理，避免了开盖污染，操作简单，可现场实时快速检测。
具体实施例方式以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。实施例1、根据 GenBank (http://www.ncb1.nlm.nih.gov)中已登录的南方菜豆花叶病毒的外壳蛋白基因序列:acggccaatg ctatcacgac cacactggac gttggacagcttggcaagaa gtggtatcct ttcaagacta gcacagattt cacaacggct gttggcgtaa atgtcaacattgccactccc ctggtcccgg cgaggcttat aatagccatg ctggatgggt cgagttctac ggctgtgagtactggacgct tatacgtgtc gt atactatt caactgatag agcccactgc，利用 DNAMAN 6.0.40软件进行比对分析，找出SBMV外壳蛋白基因序列的保守区，利用LAMP引物设计软件PrimerExplorer V4设计了 5组特异性引物,其中有I组引物不满足设计原则，合成4组:SBl组引物、SB2组引物、SB3组引物和SB5组引物，引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。4组引物分别对感染南方菜豆花叶病毒:SB-AT分离物(由中国检科院植物检疫实验所提供)、SB-D分离物(购自德国DSMZ公司)、SB-A分离物(购自美国Agdia公司)进行RT-LAMP检测。检测方法为南方菜豆花叶病毒总RNA提取:0.1 g样品经液氮处理后研碎成粉末状，用Trizol核酸提取试剂(购自Invitrogen公司)提取总RNA,得到各分离物总RNA,具体提取方法依Trizol核酸提取试剂的说明书进行；再RT-LAMP扩增:RT_LAMP扩增反应体系为2 X反应缓冲液12.5 UL,浓度8 U/μ L的DNA聚合酶液1.0 μ L，钙黄绿素荧光染料1.0 μ L，浓度20 μ M的内侧上游引物和内侧下游引物各2.0 μ L、浓度20 μ M的外侧上游引物和外侧下游引物各0.25 μ L，分离物总RNA2.5 μ L，无RNase的水补至25 μ L，反应条件为恒温63°C的水浴锅中扩增I h，再95°C 2 min，得到扩增产物。RT-LAMP引物筛选检测试验结果:SB2组引物和SB5组引物仅对SB-D和SB-A扩增产物呈黄绿色，对SB-AT扩增产物呈橙色；SB3组引物仅对SB-A扩增产物呈黄绿色，对SB-D和SB-AT扩增产物呈橙色；SBl组引物对三个分离物扩增产物均呈黄绿色，故SBl组引物为SBMV RT-LAMP检测的最佳引物。SBl组的内侧上游引物的核苷酸序列为5’ - CGCCAACAGC CGTTGTGAAA TCGTTGGACAGCTTGGCAAG A-3’，内侧下游引物的核苷酸序列为 5’- TGGTCCCGGC GAGGCTTATA AGCGTCCAGTACTCACAGC-3’，外侧上游引物的核苷酸序列为5’ - ACGGCCAATG CTATCACG-3’，外侧下游引物的核苷酸序列为5’- GCAGTGGGCT CTATCAGTTG-3’，其分别识别外壳蛋白编码基因的6个位点。实施例2、南方菜豆花叶病毒的RT-LAMP检测试剂盒可以为2X反应缓冲液
12.5 μ LX100或200等，浓度8 U/μ L的DNA聚合酶液L O μ LX 100或200等，摩尔浓度为20μΜ的内侧上游引物2.0μ LX100或200等，摩尔浓度为20μΜ的内侧下游引物
2.0 μ LX 100或200等，摩尔浓度为20 μ M的外侧上游引物0.25 μ LX 100或200等，摩尔浓度为20 μ M的外侧下游引物0.25 μ LX 100或200等，钙黄绿素荧光染料1.0 μ LX 100或200等和无RNase的水。实施例3、RT-LAMP特异性试验:用上述实施例1的RT-LAMP检测方法分别对购自美国Agdia公司的感染南方菜豆花叶病毒SB-A样品、感染菜豆荚斑驳病毒(ifea/ podmottle BPMV)样品、感染南芥菜花叶病毒 ClraAi1S mosaic Firw1S, ArMV)样品、感染烟草环斑病毒(Tobacco ringspotTRSV)样品，感染番爺环斑病毒ringspot ToRSV)样品,进行扩增,水浴温度为63°C,反应60 min,再95°C 2 min,结果感染南方菜豆花叶病毒SB-A样品扩增产物呈黄绿色，其它样品扩增产物呈橙色，说明RT-LAMP扩增反应体系对南方菜豆花叶病毒特异。实施例4、RT-LAMP灵敏性试验:用RT-PCR反应体系和上述RT-LAMP扩增反应体系分别对感染南方菜豆花叶病毒SB-AT样品总RNA进行扩增反应，RT-PCR反应的试剂盒为One-step RNA PCR kit (AMV)(购自大连宝生物公司)，RT-PCR反应依试剂盒说明书进行；RT-LAMP扩增反应用上述实施例1的RT-LAMP检测方法。25 μ L反应体系中样品总RNA浓度分别为 20ng、2ng、200pg 、20pg、2pg、200fg、20fg，结果 RT-LAMP 扩增反应最小检测限为 2pg ；RT-PCR最小检测限为20pg ;因此RT-LAMP扩增灵敏度是RT-PCR的10倍。
权利要求
1.方菜豆花叶病毒的RT-LAMP检测试剂盒，该检测试剂盒包括2X反应缓冲液，浓度8U/ μ L的Bst DNA聚合酶液，浓度为20 μ M的内侧上游引物、内侧下游引物、外侧上游引物和外侧下游引物，钙黄绿素荧光染料，所述2Χ反应缓冲液与ifei DNA聚合酶液、内侧上游引物、内侧下游引物、外侧上游引物、外侧下游引物、钙黄绿素荧光染料的体积比为12.5:1:2:2:0.25:0.25:1，其特征在于所述内侧上游引物的核苷酸序列为CGCCAACAGCCGTTGTGAAA TCGTTGGACA GCTTGGCAAG A，所述内侧下游引物的核苷酸序列为TGGTCCCGGCGAGGCTTATA AGCGTCCAGT ACTCACAGC,所述外侧上游引物的核苷酸序列为ACGGCCAATGCTATCACG，所述外侧下游引物的核苷酸序列为GCAGTGGGCT CTATCAGTTG。
2.用权利要求1所述的南方菜豆花叶病毒的RT-LAMP检测试剂盒检测南方菜豆花叶病毒的方法，其特征在于步骤如下: a、总RNA提取:0.1 g检测样品经液氮处理后研碎成粉末状，用Trizol核酸提取试剂提取总RNA，得到样品总RNA ;具体提取方法依Trizol核酸提取试剂的说明书进行； b、RT-LAMP扩增:RT-LAMP扩增反应体系为2X反应缓冲液12.5 μ L，浓度8U/ μ L的fciDNA聚合酶液1.0 μ L，钙黄绿素荧光染料1.0 μ L，浓度为20 μ M的内侧上游引物和内侧下游引物各2.0 μ L，浓度为20 μ M的外侧上游引物和外侧下游引物各0.25 μ L，样品总RNA2.5 μ L，无RNase的水补至25 μ L，反应条件为恒温63°C的水浴锅中扩增I h，再95°C 2min，得到扩增产物； C、判断:在自然光照条件下，肉眼观察扩增产物颜色，若扩增产物呈黄绿色，则样品感染南方菜豆花叶病毒，若扩增产物呈橙色，则样品中无南方菜豆花叶病毒。
全文摘要
本发明公开了南方菜豆花叶病毒的RT-LAMP检测试剂盒及检测方法，检测试剂盒包括2×反应缓冲液、BstDNA聚合酶液、内侧上游引物、内侧下游引物、外侧上游引物、外侧下游引物、钙黄绿素荧光染料，检测方法通过样品总RNA提取，RT-LAMP扩增，就可以得到检测结果，整个检测反应1.5h内即可完成，通过4条引物识别靶基因6段不同的序列，提高了检测的特异性，25μL体系中总RNA含量为2pg也能灵敏检测，其灵敏度比普通RT-PCR检测高10倍，且无需复杂的检测仪器和检测过程，反应结束后在自然光照条件下裸眼观察颜色变化，判定结果，不需进行后处理，避免了开盖污染，操作简单，可现场实时快速检测。
文档编号C12Q1/70GK103088159SQ201310011968
公开日2013年5月8日 申请日期2013年1月14日 优先权日2013年1月14日
发明者郭立新, 段维军, 徐颖, 吴薇, 陈先锋 申请人:宁波检验检疫科学技术研究院