一种基孔肯雅热病毒的恒温扩增检测试剂盒及检测方法
【专利说明】-种基孔肯雅热病毒的恒溫扩増检测试剂盒及检测方法 (-)技术领域
[0001] 本发明设及一种针对基孔肯雅热病毒核酸的恒溫扩增快速检测技术，适合对基孔 肯雅热病毒的定性检测。 (二）【背景技术】
[0002] 基孔肯雅热（化ikungunyafever,简称CHIK)是经伊蚊叮咬吸血传播由CHIK病 毒引起的一种急性传染病，属再肆虐的人兽共患病。临床上W发热、关节疼痛、皮疹和轻度 出血为特征。该病主要流行于夏、秋季节，主要分布于非洲、南亚和东南亚地区，2005-2007 年在印度洋岛蜗、印度和东南亚地区广泛流行，导致数百万人患病。2008年我国发现首例输 入性病例，2010年在广东出现暴发流行。近两年，该病流行地区不断扩大，且发病数不断 上升，成为重要的公共卫生问题。该病主要通过感染病毒的伊蚊叮咬而传播，埃及伊蚊和 白纹伊蚊为主要传播媒介，CHIKV不需要外部非人类的储存库，只要存在人类宿主和合适的 传播媒介，就可能进行传播。基孔肯雅热近年来成为严重的虫媒传染病。基孔肯雅热病毒 感染需要实验室诊断技术加W确诊，因此建立快速、准确的诊断方法十分重要。目前基孔肯 雅热病毒的实验室检测技术主要基于针对病毒RNA的核酸检测技术（如巧光定量PCR等技 术），但由于需要昂贵的巧光定量PCR仪，使得难W广泛使用。恒溫扩增技术是继PCR技术 后近年发展起来的一种新的体外核酸扩增技术，本发明技术研制了恒溫扩增基孔肯雅热病 毒核酸，并结合核酸试纸条显色来判定检测结果，且整个反应过程不打开反应管盖子，试纸 条流动检测过程密闭，杜绝了核酸扩增产物污染外界的可能性。本发明研发的基孔肯雅热 病毒核酸的恒溫扩增检测试剂盒及其检测方法检测时间短、反应灵敏、方法特异，为基孔肯 雅热检测提供了 一种可靠的快速检测方法。 (Ξ)
【发明内容】
[0003] 本发明目的是提供一种准确、灵敏、快速地检测基孔肯雅热病毒核酸的恒溫扩增 检测试剂盒及其检测方法。
[0004] 本发明采用的技术方案是：
[0005] 本发明提供一种基孔肯雅热病毒恒溫扩增检测试剂盒，所述试剂盒组成包括：
[0006] (1)RNA提取液，优选德国QIAGENRNA提取试剂盒（Qia-74104);
[0007] (2)恒溫扩增反应液，包括：正向外围引物、反向外围引物、两条探针、两条交叉扩 增引物、IX化ermolbuffer、M拆〇4、dNTPs溶液、BstDNA聚合酶、AMV逆转录酶和无菌双蒸 水；其中：
[0008] 所述正向外围引物为：5' -CTCTCCTCTCCACAGGTGTA-3'(沈QIDNO. 2 所示）；
[0009] 反向外围引物为：5' -CGCAGTCTATGGAGATGTGC-3'(沈QIDNO. 3 所示）；
[0010] 所述两条探针的序列分别为： W11] 正向5'端Biotin标记探针
[0012] 5' -Biotin-ATGGGAGAAGAAAATATCTGAGGC-3'(沈QIDNO. 4 所示）；
[0013]反向3'端Fite标记探针5' -Fitc-TGGTTCAGTGACTGGGTCAG-3'(沈Q ID NO. 5 所示）；
[0014] 所述两条扩增交叉引物分别为：
[0015] 扩增正向引物：
[0016] 5' -CCGTCGAGTCCATGGCTGTAAAACTCAGGAGGGAAAGACAGG-3'(沈QID NO. 6所示）；
[0017] 扩增反向引物： 阳0化]5' -GCAGACGTGGTCATCTACTGCCACTTGGGTCCGCATCTG T-3'(沈QID NO.7所示）；
[0019] 做阳性对照：基孔肯雅热病毒核酸；
[0020] (4)阴性对照巧菌双蒸水。
[0021] 进一步，本发明所述的IXThermol buffer组成为：20mM的Tris-肥l、10mM的 KCl、10mM的（NH4)2S〇4、2mM的Μ拆〇4^及质量浓度为0. 1%的Triton X-100，pH 8.8。
[0022] 进一步，本发明所述阳性对照为基孔肯雅热病毒核酸，所述扩增区域为长22化p 的基孔肯雅热病毒NSp4基因，序列如（SEQIDNO. 1)所示：
[0023] TGGGAGTAAATAGTGTAGCTATACCTCTCCTCTCCACAGGTGTATACTCAGGAGGGAAAGACAGGCTGA CCCAGTCACTGAACCACCTCTTTACAGCCATGGACTCGACGGATGCAGACGTGGTCATCTACTGCCGCGACAAAGAA TGGGAGAAGAAAATATCTGAGGCCATACAGATGCGGACCCAAGTAGAGCTGCTGGATGAGCACATCTCCATAGACTG CGo
[0024] 进一步，本发明所述恒溫PCR扩增反应液组成为：两条外围引物各自1化mol,两条 探针各自 20pmol，两条交叉引物各自 40pmol，lXThe;rmolbuffe;r，M拆04为7mmol，dNTPs溶 液各0.Immol，BstDM聚合酶8U，AMV逆转录酶抓，无菌双蒸水组成补足至25μ1。
[00巧]本发明还提供一种所述基孔肯雅热病毒恒溫扩增检测试剂盒的检测方法，所述检 测方法为：
[0026] a)用RNA提取试剂从待检测的标本中提取RNA ;
[0027] b)将步骤a)提取得到的RNA作为模板加入到装有恒溫扩增反应液的PCR管中，在 60°C下扩增反应35分钟；将标准阳性模板（即阳性对照）加入阳性对照PCR管中，将标准 阴性模板（即阴性对照）加入阴性对照PCR管中，所述标准阳性模板为基孔肯雅热病毒核 酸，所述标准阴性模板为无菌双蒸水；
[0028] C)将反应后的PCR管放置到核酸试纸条防污染检测装置（杭州优思达生物技术公 司3号装置）中进行检测，2分钟W后判读结果，当试纸条的检测线呈阳性时，说明样品中含 有基孔肯雅热病毒核酸。该试纸条包括在带有不干胶的衬垫上按顺序设有样品垫、有色颗 粒结合物垫和吸水滤纸垫，上述各部分在相邻处部分重叠，纤维膜上设有检测线和质控线， 其中有色颗粒结合物垫上的有色颗粒有抗Fite抗体包被，检测线灯线）上有亲和素包被， 质控线（C线）上有抗Fite抗体包被，有色颗粒选自胶体金颗粒、乳胶颗粒。2分钟W后判 读结果，当试纸条的检测线呈阳性时（即C线和T线均为红色），说明样品中含有基孔肯雅 热病毒核酸。
[0029] 在本发明提供的试剂盒中，有两条外围引物，两条交叉引物和两条检测探针。RNA 由逆转录酶逆转录成cDNA后，本试剂盒中的6条寡聚核巧酸序列依靠Bst DNA聚合酶的高 活性的链置换特性，使得链置换DNA合成不断的自我扩增循环。在本发明提供的基孔肯雅 热病毒核酸的恒溫扩增检测试剂盒中，对不同的反应条件进行了优化，如引物和探针的浓 度，Mg2+浓度，反应溫度等的优化，并将本发明与核酸检测试纸条检测系统相结合，建立了基 孔肯雅热病毒核酸恒溫扩增定性检测的方法。该试剂盒的灵敏度可在每个反应体系中检出 0.ITCIDw/ml，可W满足快速检测基孔肯雅热病毒的要求。
[0030] 本发明与现有技术相比，具有W下优点和效果：
[0031] (1)本发明所述基孔肯雅热病毒恒溫扩增检测试剂盒的特异性好，灵敏度高，步骤 简单，可重复性高；
[0032] (2)反应速度快，单个样本从样本处理到完成检测，仅需1小时左右；
[003引做整个扩增和检测过程中不需要打开PCR管盖，减少了扩增产物污染的机会；整 个反应过程不需要复杂的仪器。 (四）
【附图说明】
[0034] 图1为核酸检测试纸条原理示意图。
[0035] 图2为本发明试剂盒用于检测基孔肯雅热病毒的特异性，1-7依次为基孔肯雅热、 登革热I型、登革热II型、登革热III型、登革热IV型、黄热病病毒、乙型脑炎病毒。
[0036] 图3为本发明试剂盒用于检测基孔肯雅热病毒的灵敏度，1-7依次为10 4TCID5。/ ml、l〇3TCID5〇/ml、l〇2TCID5〇/ml、10TCID5〇/ml、lTCID5〇/ml、0.ITCIDso/ml和 0.OlTCIDso/ml。 (五）
【具