高危型人乳头瘤病毒hpv16、18荧光pcr检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于体外核酸检测领域，本发明用于对临床样品中高危人乳头瘤病毒核酸 HPV16和HPV18进行检测及分型的荧光PCR试剂盒，用于高危人乳头瘤病毒HPV16和HPV18 感染的临床早期诊断。 技术背景
[0002] 宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤之一，其发病率仅次于乳腺癌，居于第二位，尤其在 发展中国家更为普遍。据统计我国每年新病例约为18万，其中子宫颈癌死亡人数约为10 万，高于发达国家的宫颈癌发病率及死亡率。在发达国家由于宫颈癌的普查、诊断防治措施 比较完善，从而大大降低了宫颈癌的发病率及死亡率。因此，要降低宫颈癌的发病率和死亡 率，筛查癌前病变及诊断预后是关键。据研究发现，绝大部分（99. 7%)的宫颈癌患者的病理 样本中均能找到人乳头瘤病毒0?皿a/? HPV)，从而印证了 HPV是宫颈癌的 主要原因，也使宫颈癌成为目前人类所有癌症病变中唯一一个病因明确的癌症。所以HPV 的检测已逐渐成为预防和控制宫颈癌发生的重要手段。
[0003] 目前已知的约有120种HPV病毒，根据其能否致癌主要分为两类：①低危型，常见 的低危型HPV有HPV6、11、42、43、44等，低危型HPV主要感染人上皮细胞及粘膜上皮细胞， 形成乳头状瘤，即疣；②高危型（high-risk，HR)，常见的高危型HPV有HPV16、18、58、59和 68等，高危型HPV的E6、E7基因，能整合到宿主细胞的基因组中，使抑癌基因 p53及PRb基 因失活，细胞周期紊乱，导致肿瘤的发生，这是高危型HPV感染与宫颈癌发生的重要分子机 制，而在高危型的感染亚型中，检测中最常见的为HPV16及HPV18,因此本试剂盒将主要检 测HPV16及HPV18,协助宫颈癌的早期检测。
[0004] HPV不能进行体外培养，故不能用简便的血清血检测进行HPV的诊断和分型。对其 的检测主要依赖于细胞形态学检测、组织学检测及分子生物学的检测手段。传统的巴氏涂 片就属于细胞学检测方法，宫颈上皮细胞感染HPV后会产生形态学上的改变，例如凹空细 胞，细胞角质化及多核细胞等，然后通过显微观察不正常的细胞作为诊断依据。但是，这种 诊断方法受取材、涂片质量及医生的主观因素等的限制，其重复性差、敏感性只有50%-60%， 漏诊率较高。组织学检测手段与细胞学检测手段一样，准确率低而且病人痛苦程度大。相 比之下，分子生物学的检测手段则更为灵敏和高效，并且可对感染的不同HPV进行分型，有 利于疾病的预防诊断及治疗，而且HPV感染的初期症状并不明显，潜伏期较长，分子诊断的 优势在HPV感染初期更可以体现。
[0005] 近年发展起来的PCR方法则具有灵敏度高，特异性强等优点，已广泛用于核酸分 析、遗传学检测和临床检测领域。尤其是在原普通PCR的基础上，发展起来的实时荧光PCR 技术，通过引入特异性探针和荧光信号的动态监测使PCR产物的扩增及分析的全过程可以 再单管内封闭完成，并且可以对PCR扩增产物进行实时动态监测及自动分析结果，避免了 PCR后的处理，是一种先进的分子定量检测技术。荧光PCR技术有多种类型，主要分为荧光 染料嵌入技术、荧光探针技术和自身淬灭荧光技术等。本专利采用的是荧光染料嵌入技术， 该技术相对于荧光探针技术和自身淬灭荧光技术来说，成本低，特异性好，由于采用了两步 法，检测时间大大缩短，因此更适合临床使用。
【发明内容】
[0006] 本发明目的是提供一种高危型人乳头瘤病毒HPV16、18荧光PCR检测试剂盒，是用 于临床样本中高危人乳头瘤病毒HPV16和HPV18的快速检测及分型的试剂盒，可用于高危 人乳头瘤病毒HPV16和HPV18感染的辅助诊断。
[0007] 为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：一种高危型人乳头瘤病毒HPV16、 18荧光PCR检测试剂盒，试剂盒包含HPV16 PCR、HPV18 PCR反应液、阴性质控品、HPV16阳 性质控品、HPV18阳性质控品、HPV16弱阳性质控品、HPV18弱阳性质控品、裂解液及蛋白酶 K溶液，HPV16PCR反应液中包含了高危人乳头瘤病毒HPV16特异性的正向引物、反向引物； HPV16 正向引物的序列为：5' -GTATGGAACAACATCAGAAC-3'， HPV16 反向引物的序列为：5'- ACCCCGTATATTATGGAATCT-3'， HPV18PCR反应液中包含了高危人乳头瘤病毒HPV18特异性的正向引物、反向引物； HPV18 正向引物的序列为：5'- ACAGGAGAGACTCCAACGAC-3'， HPV18 反向引物的序列为：5'- ATTGTGTGACGTTGTGGTTC-3'， 裂解液为：5. OmM Na0H、10.0 mM Tris-HCl (pH8.0)、0.2mM EDTA(pH8.0)、l%(V/V) TritonX-100,0. 5% (V/V)NP40,0. 5%(V/V)Tween20, HPV16 PCR反应液还包括热启动的Taq DNA聚合酶，HPV16特异性引物、dATP、dTTP、 dGTP、dCTP四种核苷酸、含有镁离子的缓冲液， HPV18 PCR反应液还包括热启动的Taq DNA聚合酶，荧光染料，HPV18特异性引物、 dATP、dTTP、dGTP、dCTP四种核苷酸、含有镁离子的缓冲液， HPV16阳性质控品为：含插入高危人乳头瘤病毒核酸HPV16特异性保守序列的质粒 pCR2. 1载体，该重组质粒转化到大肠杆菌DH5 α中增殖后经提取纯化用分光光度计测定 浓度和纯度后用无菌TE缓冲液定量稀释；其中高危人乳头瘤病毒核酸HPV16阳性质控 品的浓度为5. 0X107C〇pieS/ml，高危人乳头瘤病毒核酸HPV16弱阳性质控品的浓度为 5. OX 103copies/ml, HPV18阳性质控品为：含插入高危人乳头瘤病毒核酸HPV18特异性保守序列的质粒 pCR2. 1载体，该重组质粒转化到大肠杆菌DH5 α中增殖后经提取纯化用分光光度计测定 浓度和纯度后用无菌TE缓冲液定量稀释，其中高危人乳头瘤病毒核酸HPV18阳性质控 品的浓度为5. 0X107C〇pieS/ml，高危人乳头瘤病毒核酸HPV18弱阳性质控品的浓度为 5. 0X103copies/ml ;阴性质控品为：灭菌去离子水。
[0008] HPV16引物与HPV18引物的衍生序列也为本发明的保护范围，所述衍生序列包括 引物序列的互补链序列，同时还可以向5'端和3'方向延伸一至数个碱基或删减一至数个 喊基得到的序列。
[0009] 本试剂盒保存于-20°C以下，尽量减少反复冻融。本发明采用的是荧光染料嵌入技 术，该技术相对于荧光探针技术和自身淬灭荧光技术来说，成本较低，特异性好，由于采用 了两步法，检测时间大大缩短，因此更适合临床使用。本发明的PCR荧光定量检测试剂盒 针对高危人乳头瘤病毒HPV16和HPV18特异性基因保守序列设计特异性PCR引物，能特异 性扩增靶DNA序列从而达到临床诊断目的。本发明与其它检测技术相比具有以下优点： 1、 相对于常规PCR技术，本产品具有操作简便，结果明了等特点，产物不用凝胶电泳检 测，完全闭管操作，有效的减低了 PCR产物污染的风险， 2、 检测速度快，整个实验操作仅需约2小时， 总之本发明的试剂盒具有成本低、灵敏度高、特异性好、操作简单、快速明了等优点，是 一种适用于临床样本中高危人乳头瘤病毒核酸HPV16和HPV18的快速检测的试剂盒。
【附图说明】
[0010] 图1是高危人乳头瘤病毒HPV16检测的线性实验数据图，图中横坐标cycle表 示扩增循环数，纵坐标Λ Rn表示荧光强度，S1-S5分别表示浓度为5. OX 10sC〇pieS/ml、 5.0X107copies/ml、5.0X10 6copies/ml、5.0X105copies/ml、5.0X104copies/ml 的阳性 质控品扩增曲线，各3个重复数据，NK为阴性质控品； 图2是根据线性实验数据拟合的HPV16检测标准曲线示意图，图中横坐标表示病毒核 酸的拷贝数，纵坐标表示Ct值； 图3是高危人乳头瘤病毒HPV16检测的线性实验溶解曲线图，横坐标代表溶解温度，纵 坐标代表突光强度； 图4是高危人乳头瘤病毒HPV18检测的线性实验数据，图中横坐标cycle表示扩增 循环数，纵坐标Λ Rn表示荧光强度，S1-S6分别表示浓度为5. OX 10s copies/ml、5. OX IO7 copies/ml>5.0XIO6 copies/ml>5.0XIO5 copies/ml>5.0XIO4 copies/ml>5. 0XIO3 copies/ml的阳性质控品扩增曲线，各3个重复数据，NK为阴性质控品； 图5是根据线性实验数据拟合的HPV18标准曲线示意图，图中横坐标表示病毒核酸的 拷贝数，纵坐标表示Ct值； 图6是高危人乳头瘤病毒HPV18检测的线性实验溶解曲线，图中纵坐标代表荧光强度， 横坐标代表溶解温度； 图7是高危人乳头瘤病毒HPV16检测的特异性实验数据图，图中横坐标cycle表示扩 增循环数，纵坐标Λ Rn表示荧光强度，A代表HPV16阳性质控品扩增曲线，B代表特异性参 考品扩增曲线；特异性参考品分别为大肠埃希菌、乙型溶血性链球菌、肺炎克雷伯氏菌、金 黄色葡萄球菌、铜绿假单胞杆菌、白色念珠菌、粪肠球菌、淋病奈瑟氏菌； 图8是高危人乳头瘤病毒HPV16检测的特异性实验数据的溶解曲线图，图中横坐标代 表溶解温度，纵坐标代表荧光强度； 图9是高危人乳头瘤病毒HPV18检测的特异性实验数据图，图中横坐标cycle表示扩 增循环数，纵坐标Λ Rn表示荧光强度，A代表HPV18阳性质控品扩增曲线，B代表特异性参 考品扩增曲线，特异性参考品分别为大肠埃希菌、乙型溶血性链球菌、肺炎克雷伯氏菌、金 黄色葡萄球菌、铜绿假单胞杆菌、白色念珠菌、粪肠球菌、淋病奈瑟氏菌；这8种特异性参考 品均未有典型的"S"型扩增曲线，说明该试剂盒特异性良好。
[0011] 图10是高危人乳头瘤病毒HPV18检测的特异性实验数据的溶解曲线，图中横坐标 代表溶解温度，纵坐标代表荧光强度的变化； 图11是高危人乳头瘤病毒HPV16检测的阴性实验数