牛羊猪犬布鲁氏菌分型荧光pcr检测试剂盒及其制备与应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术检测领域，具体涉及一种牛羊猪犬布鲁氏菌分型荧光PCR检 测试剂盒及其制备与应用。
【背景技术】
[0002] 布鲁氏菌是革兰氏阴性，无芽孢兼性细胞内寄生的细菌，是引起人畜共患传染病 布病的病原体。家畜感染后能引起母畜流产，公畜睾丸炎，导致患病家畜繁殖能力和生产性 能下降，并影响畜产品的质量和安全，可造成严重经济损失;人感染后能引起波浪热、关节 炎以及睾丸炎、附睾炎，孕妇可引起流产等，严重者可丧失劳动能力。严重影响我国畜牧业 发展和人类健康。
[0003] 布鲁氏菌的主要宿主为牛羊猪犬等家畜和野生动物，也存在于海洋动物中。通过 刀伤、擦伤、口腔粘膜、鼻腔、眼结膜、生殖道，甚至未损伤的皮肤等途径而感染。人的感染几 乎都是由于接触感染动物所致，人和人之间的传播罕见(母乳感染婴儿除外）。
[0004] 布鲁氏菌属目前分为10个种，包括牛种(B.abortus)、羊种(B.melitensis)、猪种 (B. suis)、犬种(B. canis)、绵羊附睾种(B.ovis)、沙漠森林野鼠种(B.neotomae)、田鼠种 (B.microti)、B.ceti(分离自鲸鱼和海豚）、13.口;[11111口6(113118(分离自鳍足类）、和 B. inopinata(分离自病人）。
[0005] 每年由于牛羊流产给养殖业造成了巨大的经济损失，猪和犬感染也比较常见，这 些动物与人类关系密切，容易导致人换布鲁氏病。
[0006] 目前用于布鲁氏菌分型的方法很多，有限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)、Rep-PCR和ERIC-PCR、rpoB基因多态性、多位点测序分型(MLST)及测序法等。但没有统一的标准， 很多方法都存在实验过程比较繁琐、耗时，且多数方法都有一部分非典型株用现有方法无 法分型。严重影响了布病的流行病学调查和疫病预防。
[0007] 基于荧光定量PCR法联合检测布鲁氏菌羊种、猪种、犬种和牛种布鲁氏菌试剂盒能 够快速诊断出哪种布鲁氏菌感染，更简便快捷准确地对布鲁氏菌属进行分型。有利于分子 流行病学调查、病原菌的溯源及分析菌株间的差异关系。
【发明内容】
[0008] 针对现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供一种牛羊猪犬布鲁氏菌分 型荧光PCR检测试剂盒及其制备与应用。
[0009] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0010] 本发明的第一方面，提供一种牛羊猪犬布鲁氏菌分型荧光PCR检测试剂盒，所述试 剂盒中包括牛布鲁氏菌检测引物及探针、羊布鲁氏菌检测引物及探针、猪布鲁氏菌检测引 物及探针、犬布鲁氏菌检测引物及探针，所述牛布鲁氏菌检测引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示的下游引物，牛布鲁氏菌检测探 针的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示，所述羊布鲁氏菌检测引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示的下游引物，所述羊布鲁氏菌检测 探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述猪布鲁氏菌检测引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的下游引物，所述猪布鲁氏菌检 测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述犬布鲁氏菌检测引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO. 10所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO. 11所示的下游引物，所述犬布鲁氏菌 检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO. 12所示，所述牛布鲁氏菌检测探针、羊布鲁氏菌检测 探针、猪布鲁氏菌检测探针、犬布鲁氏菌检测探针标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团。 [0011]优选地，所述牛布鲁氏菌检测探针、羊布鲁氏菌检测探针、猪布鲁氏菌检测探针、 犬布鲁氏菌检测探针的5 '端标记有荧光报告基团，3 '端标记有荧光淬灭基团。
[0012] 进一步优选地，所述牛布鲁氏菌检测探针5'端标记的荧光报告基团为FAM荧光基 团，3 '端标记的荧光淬灭基团为BHQ-1。
[0013] 进一步优选地，所述羊布鲁氏菌检测探针5'端标记的荧光报告基团为HEX荧光基 团，3 '端标记的荧光淬灭基团为BHQ-1。
[0014]进一步优选地，所述猪布鲁氏菌检测探针5'端标记的荧光报告基团为Cal Red 610荧光基团，3'端标记的荧光淬灭基团为BHQ-2。
[0015] 进一步优选地，所述犬布鲁氏菌检测探针5'端标记的荧光报告基团为CY5荧光基 团，3'端标记的荧光淬灭基团为BHQ-3。
[0016] 本发明的试剂盒采用多重荧光PCR技术在单管中同时进行牛羊猪犬布鲁氏菌的检 测，根据扩增及检测情况可分析判断布鲁氏菌感染情况、并对所感染布鲁氏菌进行准确分 型。因此，引物及探针的设计是本发明试剂盒的关键。
[0017] 基于本发明所述试剂盒是采用多重荧光PCR技术来进行检测的，所以试剂盒中还 可以包括其他一些PCR所需要的常规试剂，如：dNTP、MgCl 2、PCR缓冲液、Taq DNA聚合酶、尿 嘧啶-N-糖基化酶(UNG)、PCR缓冲液、无菌水(ddH20)的一种或多种。由于此类PCR常用试剂 均可经市场途径单独购得或者自行配置，因此具体需要将哪些试剂装配入试剂盒，可以根 据客户实际需要配置，为方便起见，也可全部装配入试剂盒。
[0018] 所述PCR反应体系中，引物、探针、dNTP、MgCl2、PCR缓冲液、Taq DNA聚合酶、尿嘧 啶-N-糖基化酶(UNG)、PCR缓冲液、无菌水(ddH20)均为常见组分，其含量亦为常规。
[0019] 所述PCR反应体系可自行配置，也可直接以市售的不含引物及探针的通用PCR反应 液加入引物及探针获得。例如，所述试剂盒中还可以dNTP、MgCl 2、PCR缓冲液、Taq DNA聚合 酶、尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG)、无菌水(ddH20)，加入本发明的引物及探针、待检样本即可获 得PCR反应体系。
[0020] 所述试剂盒中还可含有阳性对照。所述阳性对照为含有牛布鲁氏菌阳性对照质 粒、羊布鲁氏菌阳性对照质粒、猪布鲁氏菌阳性对照质粒、犬布鲁氏菌阳性对照质粒的溶 液。可单独市购或根据现有技术自行构建。
[0021] 所述试剂盒中还可含有阴性对照。阴性对照可为各种不含有牛羊猪犬布鲁氏菌的 溶液，如PCR反应缓冲液、无菌水(ddH20)、生理盐水等。
[0022] 本发明的第四方面，提供了前述牛羊猪犬布鲁氏菌分型荧光PCR检测试剂盒的使 用方法，包括如下步骤：
[0023] (1)提取样品基因组DNA;
[0024] (2)加样：将样品基因组DNA、阳性对照或阴性对照分别加入装有PCR反应体系的 PCR管中，获得对应的样品反应管、阳性反应管或阴性反应管，所述PCR反应体系中含有前述 牛羊猪犬布鲁氏菌分型荧光PCR检测引物及探针；
[0025] (3 )PCR反应:反应管置于PCR仪上，设置循环参数，进行PCR反应；
[0026] (4)PCR反应结束后，分析结果。
[0027]步骤(1)中，提取样品基因组DNA为现有技术。
[0028] 优选地，步骤(3)中，PCR反应的条件设置为：37°C X2min;94°C X2min;再按93°C X 15sec-6(TC X60sec，循环40次。
[0029] 本发明的第三方面，提供了前述试剂盒在制备牛羊猪犬布鲁氏菌分型检测产品中 的用途。
[0030] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0031]本发明采用多重荧光PCR检测试剂盒，设计了牛布鲁氏菌检测引物及探针、羊布鲁 氏菌检测引物及探针、猪布鲁氏菌检测引物及探针、犬布鲁氏菌检测引物及探针，在单个 PCR反应管中同时检测4种类型的布鲁氏菌，能够在检测布鲁氏菌是否存在的同时对其进行 准确的分型，缩短了实验周期，提高了检测效率，为及时检测并诊断布鲁氏菌的类型提供了 有力工具。
[0032]本发明所采用的荧光PCR检测试剂盒灵敏度高，最低检出限为lX103c〇py/ml，准 确率及阳性率均高达100%;所用引物和探针均基于GenBank公共数据库中序列设计，特异 性好;操作简便，无需对PCR产物进行额外处理。PCR扩增和荧光检测在同一反应管中进行， 全程处于封闭状态，大大降低了样本间交叉污染和环境污染的风险。可直接对各种类型的 样品进行检测，无需富集培养。
【附图说明】
[0033]图1A:待检布鲁氏菌分型阳性对照品（S1~S4，从左自右分别为SI、S2、S3、S4)在 FAM荧光通道下的扩增曲线。
[0034]图1B:待检布鲁氏菌分型阳性对照品（S1~S4，从左自右分别为SI、S2、S3、S4)在 HEX荧光通道下的扩增曲线。
[0035]图1C:待检布鲁氏菌分型阳性对照品（S1~S4，从左自右分别为S1、S2、S3、S4)在 Cal Red 610荧光通道下的扩增曲线。
[0036]图1D:待检布鲁氏菌分型阳性对照品（S1~S4，从左自右分别为SI、S2、S3、S4)在 CY5荧光通道下的扩增曲线。
[0037] 图2A:SA阳参以及待检样本34-1、34-2、34-3、34-4(从左自右分别为3六阳参以及待 检样本SA-1、SA-2、SA-3、SA-4)在FAM荧光通道下的扩增曲线。
[0038] 图2B: SM阳参以及待检样本SM-1、SM-2、SM-3、SM-4 (从左自右分别为SM阳参以及待 检样本SM-1、SM-2、SM-3、SM-4)在HEX荧光通道下的扩增曲线。
[0039] 图2C: SS阳参以及待检样本SS-1、SS-2、SS-3、SS-4 (从左自右分别为SS阳参以及待 检样本33-1、33-2、33-3、33-4)在〇&11^(1610荧光通道下的扩增曲线。
[0040] 图2D: SC阳参以及待检样本SC-1、SC-2、SC-3、SC-