一种苹果褪绿叶斑病毒检测试剂盒及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及微生物检测领域，具体地说，本发明设及一种苹果稱绿叶斑病毒检测 试剂盒及检测方法。
【背景技术】
[0002] 苹果属菩微科苹果属，多年生落叶果树，原产于亚洲中部、欧洲东南及新疆西部。 苹果病毒是导致苹果果树传染病的主要因素，大多通过嫁接、修剪等传染。若病毒在植株体 内长年积累，将会引发严重后果。由于病毒是专性寄生，当其大量繁殖时，会干扰果树正常 繁殖代谢，引起树体长势减弱、叶片萎缩翻卷和果实崎形、风味变劣，果树提早枯死，甚至绝 产，严重影响苹果的产量。因此，早期对苹果果树进行病毒检测W及时采取防控措施，已迫 在眉睫。
[0003] 苹果稱绿叶斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus,ACLSV)是果树传染病的 最主要病原体之一，又名苹果潜隐病毒1，属于纤毛病毒属(Trichovirus)，主要侵染苹果、 梨、核果类果树及菩藻科观赏品种等。被苹果稱绿叶斑病毒侵染的果树植株，树体长势日趋 衰退，叶片上会出现稱绿色如黄色斑点或条状斑，卷缩变小或向对侧弯曲，严重影响叶片的 光合作用面积。
[0004] 苹果稱绿叶斑病毒是一种正义单链RNA病毒，为弯曲柔软的纤维状条形，无銷膜， 其碱基长度约为7.化b，核酸分子量大概是2500kDa，外壳蛋白由多肤组装而成，分子量约为 22kDa。目前对苹果稱绿叶斑病毒的检测，多采用传统的肉眼观察、血清学法W及分子生物 学检测方法，如RT-PCR。然而，传统方法耗时长，灵敏度不高，特异性差，对检测人员的水平 要求相对较高;血清学方法费用昂贵，操作步骤多，耗时较长，且样品中可能存在与抗体发 生非特异性反应的杂质，易出现假阳性结果，因此只适合于初筛;而常规RT-PCR的特异性和 灵敏度也不高。为了适应产业发展需求，有必要开发一种能够更加快速、准确地对苹果稱绿 叶斑病毒进行检测的方法。
[0005] 环介导恒溫扩增技术（loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是近些 年发展起来的一种新型的核酸扩增方法（见文献Notomi T，0kayama H，Masubuchi Η, Yonekawa T,Watanabe Κ,Amino N,Hase T.Loop-mediated isothermal amplification of DNA.Nucleic Acids Res.2000Jun 15;28(12):E63)。与常规PCR相比，LAMP无需模板的 热变性、溫度循环、电泳及紫外观察等过程，短时间内即可实现大量拷贝数的核酸扩增，且 无需高端的仪器设备，具有特异性强、灵敏度高、易于判读、可定性定量等优势。
[0006] 逆转录-环介导恒溫扩增技术(RT-LAMP)是基于LAMP建立的RNA检测技术，其灵敏 度是普通RT-PCR的100倍。RT-LAMP扩增原理与LAMP相同，但在反应体系中增加了逆转录酶， 使RNA的逆转录和cDNA的LAMP扩增在同一试管中一步完成。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种苹果稱绿叶斑病毒检测试剂盒及检测方法。
[0008] 为了实现本发明的目的，在一个方面中，本发明提供了一种苹果稱绿叶斑病毒检 测试剂盒，其特征在于包括4条特异性引物:外引物F3,其序列如SEQ ID NO: 1所示;外引物 63，其序列如56〇10^:2所示；内引物尸1口，其序列如56〇10^:3所示；内引物81口，其序列 如SEQ ID N0:4所示。引物序列具体如下：
[0009] 外引物F3:ATGGAGGATCAGAAAGTGAT(沈Q ID N0:1)
[0010] 外引物B3:TGGTTGTAAAGAGGTTTGTGA(SEQ ID N0:2)
[0011] 内引物FIP:TGGGTCCGAAGATGTAGTCTTGA-GTCATACAATCTGAAGGAGGT(沈Q ID N0:3)
[0012] 内引物BIP:TCAGCAACATGACTTTCCGTCAG-CCTTTATACTTCAATTTCACCAAC(沈Q ID NO: 4)。
[0013] 优选所述外引物F3和B3的浓度均为SpmolAU，所述内引物FIP和BIP的浓度均为 40ρηιο1/μ1。
[0014] 进一步地，本发明的试剂盒还可W包括反应缓冲液、AMV逆转录酶、Bst DNA聚合酶 和核酸染料，其中所述反应缓冲液由lOmM dNTP、10X化ermoPol反应缓冲液、5mM甜菜碱和 50mM MgS〇4组成。
[0015] 优选所述核酸染料为SYBR Green I。
[0016] 进一步地，本发明的试剂盒还可W包括RNA提取试剂W及阳性对照和阴性对照。
[0017] 在另一个方面中，本发明还提供了一种苹果稱绿叶斑病毒检测方法，其利用RT- LAMP技术，包括W下步骤：
[001引（1)提取待测样品RNA;
[0019] (2)设计并合成引物；
[0020] (3)建立25μ1的RT-LAMP反应体系，其包括5ρπιο1/μ1的外引物F3化l、5pmolAU的 外引物B3化1、40ρπιο1/μ1的内引物FIP化1、40ρπιο1/μ1的内引物BIP化1、反应缓冲液2.化 1、2U AMV逆转录酶化1、洲Bst DNA聚合酶化1、模板DNA化1，加水补充至25μ1，并W苹果稱 绿叶斑病毒基因组DNA作为阳性对照，WlOOmM化is-HCl pH 8.0和50mM抓ΤΑ作为阴性对 照；
[0021] (4)LAMP反应:将步骤(3)中PCR管于63°C恒溫反应60min;
[0022] (5)分析判断反应产物结果:在(4)中所得反应产物中加入化1核酸染料，根据反应 液的颜色判断是否存在苹果稱绿叶斑病毒。
[0023] 在本发明的检测方法中，所述外引物F3的序列如SEQ ID NO: 1所示，外引物B3的序 列如SEQ ID N0:2所示，内引物FIP的序列如SEQ ID N0:3所示，内引物BIP的序列如SEQ ID NO: 4所示。
[0024] 优选所述反应缓冲液由lOmM dNTP、10X化ermoPol反应缓冲液、5mM甜菜碱和50mM MgS〇4组成。
[0025] 优选所述核酸染料为SYBR Green I，如反应液颜色为澄色，表示结果为阴性，待测 样品中不含ACLSV;如反应液颜色为绿色，表示结果为阳性，待测样品中含有ACLSV。
[00%] 本发明的苹果稱绿叶斑病毒检测试剂盒和检测方法利用RT-LAMP技术，针对M：LSV 保守区域设计4条特异性引物，其识别A化SV的6个特定区域，特异性和灵敏度更高。反应在 等溫(63°C)条件下进行，不需要循环仪等昂贵的仪器，一步完成逆转录和扩增步骤，假阳性 率低、快速、高效，且通过肉眼观察颜色变化即可判定结果，无需电泳和紫外观察等步骤，鉴 定简便，较传统的检测方法优势显著，适合基层实验室的快速诊断，易于大范围推