广应用， 具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。
【具体实施方式】
[0027] W下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0028] 实施例1苹果稱绿叶斑病毒特异性检测
[0029] 1.1试剂的准备
[0030] 引物由天根生化科技(北京）有限公司合成；QIAamp RNA Mini Kit购自Qiagen; Bst DM聚合酶和10 X ThermoPo 1反应缓冲液购自肥B; AMV逆转录酶购自Promega公司；SYBR Green I购自Invitrogen;其余PCR试剂和配制CTAB抽提缓冲液所需的试剂购自Sigma。
[0031] 同时，配制W下RT-LAMP反应中所需试剂：
[0032] 反应缓冲液，按照W下配方配制：lOmM dNTP、10 X化ermoPol反应缓冲液、5mM甜菜 碱、50mM MgS〇4;
[0033] 引物:外引物尸3，其序列如569 10^):1所示；外引物83，其序列如569 10^):2所 示；内引物FIP，其序列如SEQ ID N0:3所示，内引物BIP，其序列如SEQ ID N0:4所示。其中外 引物F3和外引物B3的浓度为5ρπιο1/μ1，内引物FIP和内引物BIP的浓度为40ρπιο1/μ1。
[0034] 2U的AMV逆转录酶；
[0035] 8U的Bst DNA聚合酶；
[0036] 核酸染料：1000 XSYBR Green I;
[0037] 阳性对照:苹果稱绿叶斑病毒基因组DM;
[0038] 阴性对照：100mM Tris-肥 1(抑 8.0)和50mM 邸ΤΑ。
[0039] 1.2RT-LAMP 检测
[0040] 待测样品包括采自河北农业大学标本园带有花叶症状且采用血清学方法确定已 感染苹果稱绿叶斑病毒的4株果树幼嫩枝条W及感染苹果花叶病毒、苹果茎沟病毒、苹果茎 痘病毒的室内组培苗各1株。
[0041 ]按照W下步骤对苹果稱绿叶斑病毒进行检测：
[0042] (1)利用QIAamp RNA Mini Kit提取待测样品RNA;
[0043] (2)建立LAMP反应体系：在PCR管中制备25μ1反应体系，其中四种引物各化1、反应 缓冲液2.扣1、2U AMV逆转录酶化1、8U Bst DNA聚合酶化1、步骤（1)所得模板DNA化1，加水 补充至25μ1，并W苹果稱绿叶斑病毒基因组DNA作为阳性对照，WlOOmM化is-HCl pH 8.0 和50mM邸ΤΑ作为阴性对照；
[0044] (3)LAMP反应:将步骤(2)中PCR管于63°C恒溫反应60min;
[0045] (4)分析判断反应产物结果：在(3)中所得反应产物中加入化11000XSYBR Green I，如反应液颜色为澄色，表示结果为阴性;如反应液颜色为绿色，表示结果为阳性。
[0046] 1.3检测结果
[0047] 确定已感染苹果稱绿叶斑病毒的4株果树幼嫩枝条W及阳性对照的PCR管中均呈 现绿色，而另外巧巾常见的侵染苹果果树的病毒:苹果花叶病毒、苹果茎沟病毒、苹果茎痘病 毒W及阴性对照的显色结果均为澄色，表明引物对于苹果稱绿叶斑病毒具有很强的特异 性。
[004引实施例2苹果稱绿叶斑病毒灵敏度检测
[0049] 2.1RT-LAMP 灵敏度检测
[0050] 按照实施例1的步骤（1)提取4株枝条的RNA，并W10倍浓度系列稀释法稀释成 lOOng、lOng、Ing、lOOpg、lOpg、Ipg、lOOfg共 7 个梯度。
[0051] RT-LAMP反应体系和反应条件W及结果分析同实施例1的步骤(2)-(4)。
[0化2] 2.2检测结果
[0化3]除了DNA浓度为lOOfg的PCR管显示澄色之外，其余浓度的PCR管中均呈现绿色，表 明本发明的检测方法的最低检测极限达到Ipg DNA，灵敏度很高。
【主权项】
1. 一种苹果褪绿叶斑病毒检测试剂盒，其特征在于包括4条特异性引物：外引物F3，其 序列如SEQ ID N0:1所示；外引物B3,其序列如SEQ ID N0:2所示；内引物FIP，其序列如SEQ ID N0:3所示；内引物BIP，其序列如SEQ ID N0:4所示。2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其进一步包括反应缓冲液、AMV逆转录酶、Bst DNA聚 合酶和核酸染料。3. 根据权利要求2所述的试剂盒，其中所述反应缓冲液由10mM dNTP、10 X ThermoPol反 应缓冲液、5mM甜菜碱和50mM MgS〇4组成。4. 根据权利要求2所述的试剂盒，其中所述核酸染料为SYBR Green I。5. 根据权利要求1或2所述的试剂盒，其进一步包括RNA提取试剂以及阳性对照和阴性 对照。6. -种苹果褪绿叶斑病毒检测方法，其包括以下步骤： (1) 提取待测样品RNA; (2) 设计并合成引物； (3) 建立25μ1的RT-LAMP反应体系，其包括5ρπιο1/μ1的外引物F3 1μ1、5ρπιο1/μ1的外引 物Β3 1μ1、40ρπιο1/μ1 的内引物FIP 1μ1、40ρπιο1/μ1 的内引物ΒΙΡ ΙμL、反应缓冲液2·5μ1、2υ AMV逆转录酶lyl、8U Bst DNA聚合酶ΙμL、模板DNA 2μ1，加水补充至25μ1，并以苹果褪绿叶 斑病毒基因组DNA作为阳性对照，以100mM Tris-HCl pH 8.0和50mM EDTA作为阴性对照； (4) LAMP反应:将步骤(3)中PCR管于63°C恒温反应60min; (5) 分析判断反应产物结果:在(4)中所得反应产物中加入?μL核酸染料，根据反应液的 颜色判断是否存在苹果褪绿叶斑病毒。7. 根据权利要求6所述的检测方法，其中所述外引物F3的序列如SEQ ID NO: 1所示，外 引物B3的序列如SEQ ID N0:2所示，内引物FIP的序列如SEQ ID N0:3所示，内引物BIP的序 列如SEQ ID NO:4所示。8. 根据权利要求6所述的苹果褪绿叶斑病毒RT-LAMP检测方法，其中所述反应缓冲液由 10mM dNTP、10XThermoPol反应缓冲液、5mM甜菜碱和50mM MgS〇4组成。
【专利摘要】本发明公开了一种苹果褪绿叶斑病毒的逆转录-环介导恒温扩增(RT-LAMP)检测试剂盒，其包括引物、反应缓冲液、AMV逆转录酶、Bst？DNA聚合酶和核酸染料。本发明还公开了对苹果褪绿叶斑病毒进行检测的方法。本发明的试剂盒及检测方法具有快速、操作简单、灵敏度高、特异性强等优点，适合基层实验室的快速诊断，易于大范围推广应用，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。
【IPC分类】C12Q1/68, C12Q1/70
【公开号】CN105543417
【申请号】CN201610125355
【发明人】魏芳
【申请人】魏芳
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2016年3月7日