一种柯萨奇病毒a6型核酸的检测试剂盒及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属生物技术领域，涉及一种核酸检测试剂盒，具体涉及一种快速柯萨奇病 毒A6型的实时荧光定量逆转录PCR检测试剂盒，可应用于公共卫生单位和临床医疗单位， 以对柯萨奇病毒A6型引起的手足口病暴发疫情、聚集性病例和临床病例进行快速、定性或 定量检验。
【背景技术】
[0002] 手足口病是由多种肠道病毒（human enterovirus，HEV)引起的出瘆发热性急性传 染病，主要感染婴幼儿。该病报道最早见于20世纪50年代末，并分别于1958年、1969年 从临床样品中成功分离得到柯萨奇病毒A16型和肠道病毒71型两种病原体。之后数十年 中，柯萨奇病毒A16型和肠道病毒71型在世界不同国家和地区交替流行，被认为是手足口 病最重要的病原体。但是自2008年起，另一种可以引起手足口病的肠道病毒--柯萨奇病 毒A6型，其感染性和致病力突然增强。短短数年间在欧洲（芬兰、法国、西班牙、英国）、东 亚（日本、中国台湾）、东南亚（新加坡、泰国）、美洲（美国、古巴）和大洋洲（新西兰）的 许多国家和地区引起不同规模的流行，甚至造成较为严重的公共卫生事件。作为手足口病 流行较广的中国，近几年来也呈现出病原谱组成发生改变的新情况。如2011年深圳市数据 显示，柯萨奇病毒A6型已取代柯萨奇病毒A16型，成为该市手足口病排名第二位的病原体。 2012年，湖北十堰、福建福州等多地的柯萨奇病毒A6型感染均上升明显，也成为当地手足 口病最主要的病原体之一。2013年初，北京、西安、河南、江苏、广东以及全国多地柯萨奇病 毒A6型感染在短时间内急剧上升，首次出现全国范围内的柯萨奇病毒A6型手足口疫情。综 合国内外情况，柯萨奇病毒A6型极有可能稳定地成为手足口病主要病原体，在未来与肠道 病毒71型、柯萨奇病毒A16型长期并存，交替流行，改变手足口病流行的既有规律。因此， 开展对柯萨奇病毒A6型肠道病毒的日常监测和临床检验已十分必要。
[0003] 长久以来实验室对柯萨奇病毒A6型的鉴定多采用对病毒基因扩增后测序的方式 实现，显然不适合应用在大量样品的日常筛检以及突发公共卫生事件的快速检验之中。近 期有个别品牌的同时检测柯萨奇病毒A6型和其它某型肠道病毒的双通道检测试剂产品面 世。虽然提供了一种检测方法，但是因其是双通道产品，成本较高，应用在柯萨奇病毒A6型 的专项检测工作时，存在严重浪费的情况。因此建立一套成熟、稳定、经济的，专门针对柯萨 奇病毒A6型肠道病毒检测的方法，以满足疾控机构和医疗单位开展柯萨奇病毒A6型的日 常监测和应急检验需求，为新形势下手足口病防控提供技术支持。
【发明内容】
[0004] 有鉴于此，本发明的目的是提供一种柯萨奇病毒A6型的核酸检测试剂盒及检测 方法。
[0005] 为实现以上目的，本发明采用以下技术方案：
[0006] 一种柯萨奇病毒A6核酸的检测试剂盒，包括：柯萨奇病毒A6正向引物、反向引物 以及特异性荧光探针，其中所述柯萨奇病毒A6正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示、 所述柯萨奇病毒A6反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示，所述特异性荧光探针的核苷 酸序列如SEQ ID No. 3,其5'端标记有荧光报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团。
[0007] 在一些实施方案中，所述特异性荧光探针的荧光报告基团选自FAM、VIC、JOE、TET、 CY3、CY5、R0X、Texas Red 或 LC RED640 中的任一种，荧光淬灭基团选自 BHQ1、BHQ2、BHQ3、 Dabcyl或Tamra中的任一种。
[0008] 在一些实施方案中，所述的核酸检测试剂盒，还包括实时荧光PCR反应液、逆转录 体系、柯萨奇病毒A6型标准品和DEPC处理水中至少一种。
[0009] 在一些实施方案中，所述实时荧光PCR反应液由PCR缓冲液、耐热Taq DNA聚合酶、 硫酸镁、三磷酸脱氧核糖核苷酸混合物组成。
[0010] 在一些实施方案中，所述逆转录体系由MMLV逆转录酶、RNA酶抑制剂和随机引物 组成。
[0011] 在一些实施方案中，柯萨奇病毒A6型标准品为含有柯萨奇病毒A6型VPl基因部 分序列的阳性质粒。
[0012] 在一些优选实施方案中，所述含有柯萨奇病毒A6型VPl基因部分序列的阳性质粒 的序列如SEQ ID NO. 4所示。
[0013] 本发明还提供了一种柯萨奇病毒A6核酸的检测方法，提取待测样品RNA，以待测 样品RNA为模板，在柯萨奇病毒A6正向引物、反向引物、特异性焚光探针及实时焚光PCR反 应液、逆转录体系和DEPC处理水存在下进行实时荧光定量PCR反应，根据实时荧光PCR的 扩增曲线分析待测样品；其中所述柯萨奇病毒A6正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所 示、所述柯萨奇病毒A6反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示，所述特异性荧光探针的 核苷酸序列如SEQ ID No. 3,其5'端标记有荧光报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团。
[0014] 在一些实施方案中，所述正向引物、反向引物和特异性荧光探针的摩尔比为 7:7:2。
[0015] 在一些实施方案中，所述实时荧光定量PCR反应程序为：45°C，15min ;95°C，2min ; 然后40个循环，每个循环95°C，15s ;60°C，60s。
[0016] 本发明提供的柯萨奇病毒A6型核酸的检测试剂盒至少具有如下技术效果之一：
[0017] 1、本发明所述试剂盒中各组分配制体系时操作简单便捷，PCR扩增时间较短，约为 60-70min，PCR体系各组分加量完毕后反应管始终封闭，降低了发生实验室污染的几率，且 具有高度的特异性和敏感性。
[0018] 2、本发明所述试剂盒可以对柯萨奇病毒A6型进行定量检测和定性检测，适合对 手足口病病人的病情进展情况和临床治疗效果进行评估。
[0019] 3、本发明所述试剂盒采用单通道检测技术，对PCR扩增仪要求低，适合针对柯萨 奇病毒A6型的大样本量的专门筛检，结果稳定可靠。
【附图说明】
[0020] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0021] 图1示实施例1五组引物探针对阳性临床样品A的PCR扩增结果对比图，其中，图 中曲线1-5分别代表第1组-第5组引物探针对；
[0022] 图2示实施例1五组引物探针对阳性临床样品B的PCR扩增结果对比图，其中，图 中曲线1-5分别代表第1组-第5组引物探针对；
[0023] 图3示实施例2不同引物探针摩尔配比对同一阳性临床样品样本的PCR扩增结果 对比图；
[0024] 图4示实施例5采用本发明实施例3所述试剂盒检测对柯萨奇病毒A6型阳性临 床标本的检测结果图；
[0025] 图5示试验例1采用本发明实施例3所述试剂盒对不同稀释度标准品的扩增曲 线，A、B、C、D、E、F 代表分别代表1. 0 X 107copies/mL、I. 0 X 106copies/mL、I. 0 X IO5Copies/ mL、I. 0 X 104copies/mL、I. 0 X 103copies/mL 和 I. 0 X 102copies/mL 浓度的标准品；
[0026] 图6示试验例1采用本发明实施例3所述试剂盒对不同稀释度标准品绘制的标 准曲线，横坐标为PCR反应起始拷贝数的对数，纵坐标为CT值，A、B、C、D、E、F代表分别 代表1. 0X 107copies/mL、I. 0X 106copies/mL、I. 0X 105copies/mL、I. 0X 104copies/mL、 1.0 X 103copies/mL 和 1.0 X 102copies/mL 浓度的标准品；
[0027] 图7示试验例2采用本发明实施例3所述试剂盒检测柯萨奇病毒A6型的特异性 实验结果图，仅有柯萨奇病毒A6型出现特异性扩增曲线，肠道病毒71型、柯萨奇病毒A16 型、A4型、AlO型、B2型、B3型、埃可病毒1型、A组轮状病毒、甲型流感病毒H3型、新HlNl 型、乙型流感病毒Victoria型、Yamagata型、麻瘆病毒和风瘆病毒，均无特异性扩增曲线产 生。
【具体实施方式】
[0028] 下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述， 显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的 实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都 属于本发明保护的范围。
[0029] 本发明提供了一种柯萨奇病毒A6核酸的检测试剂盒，包括：柯萨奇病毒A6正向引 物、反向引物以及特异性荧光探针。
[0030] 引物是在聚合作用的起始时，与反应物以共价键形式连接的一段短的单链核苷酸 序列，作为核苷酸聚合作用的起始点，核酸聚合酶可由其3'端开始合成新的核酸链。本发 明所述柯萨奇病毒A6核酸的检测试剂盒中所述柯萨奇病毒A6正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示、所述柯萨奇病毒A6反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0031] 本领域技术人员可以理解，本发明所述柯萨奇病毒A6正向引物和所述柯萨奇病 毒A6反向引物可以分别各自独立的存在于本发明所述柯萨奇病毒A6核酸的检测试剂盒 中。
[0032] 本领域技术人员也可以理解，本发明所述柯萨奇病毒A6正向引物和所述柯萨奇 病毒A6反向引物可以以引物混合液形式存在于本发明所述柯萨奇病毒A6核酸的检测试剂 盒中。所述引物混合液中所述柯萨奇病毒A6正向引物与所述柯萨奇病毒A6反向引物的摩 尔比为1:1。
[0033] 实时荧光PCR扩增时，在加入一对引物的同时需加入一个特异性的荧光探针，该 探针为一段5'端和3'端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团，可以特异性与 PCR产物以共价键形式结合的寡核苷酸序列。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭 基团吸收；PCR扩增时，探针与PCR产