一种兼抗肠道病毒71和柯萨奇病毒a16的基因工程疫苗的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药领域，具体地说，本发明涉及一种兼抗肠道病毒71和柯萨奇 病毒A16的基因工程疫苗及其应用。
【背景技术】
[0002] 手足口病（Hand,footandmouthdisease,HFMD)是在5岁以下儿童中流行的 常见疾病，肠道病毒71型（Enterovirus71，EV71)和柯萨奇病毒A16型（Coxsackievirus A16，CA16)是手足口病的主要致病原，二者均属于小RNA病毒科人类肠道病毒属。流行病学 调查显示,EV71感染是导致手足口病重症和死亡的主要原因。CA16感染一般导致较轻的症 状，如发热，口部溃疡，手足部疱疹等，但近几年的流行病学调查显示，人感染CA16后导致 严重神经症状和死亡的数量正在增加。此外，目前EV71和CA16病毒共同流行，使得部分患 者同时感染两种病毒，导致病情加重；而且有可能造成病毒重组，产生毒力强的新病毒。因 此，迫切需要开发能够同时预防EV71和CA16感染的疫苗。
[0003] 目前，手足口病疫苗的开发主要是针对EV71，不论是灭活EV71全病毒疫苗还是 EV71病毒样颗粒（Virus-likeparticles，VLPs)疫苗，对CA16都没有交叉保护能力。因 此，本领域中需要开发一种能够抗CA16的疫苗产品。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种抗原表位肽及其应用。
[0005] 本发明的另一目的是提供融合有上述抗原表位肽的融合蛋白。
[0006] 在本发明的第一方面，提供了一种抗原表位肽，所述抗原表位肽源自柯萨奇病毒 的中和表位PEP71，并且所述的抗原表位肽长度为5-15个氨基酸，并且所述抗原表位肽与 载体蛋白融合后所形成的重组蛋白可诱发哺乳动物产生针对该抗原表位肽的免疫反应。
[0007] 在另一优选例中，所述柯萨奇病毒为柯萨奇病毒A16。
[0008] 在另一优选例中，所述抗原表位肽长度为6-14个氨基酸。
[0009] 在另一优选例中，所述抗原表位肽其序列与SEQIDNO. : 1所TK的多肽序列同源， 且具有SEQIDNO. :1所示多肽的活性。所述同源是指本发明的抗原表位肽包括SEQID NO. :1所示多肽的衍生物和类似物。
[0010] 在另一优选例中，所述抗原表位肽选自下组：
[0011] (a)具有SEQIDNO: 1氨基酸序列的多肽；
[0012] (b)将SEQIDNO: 1氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而 形成的，且与载体蛋白融合后所形成的重组蛋白可诱发哺乳动物产生针对该抗原表位肽的 免疫反应的由（a)衍生的多肽。
[0013] 在另一优选例中，所述抗原表位肽序列如SEQIDNO. :1所示。
[0014] 本发明的第二方面，提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白是如本发明第一方面所 述的抗原表位肽与载体蛋白融合所形成的。
[0015] 在另一优选例中，所述载体蛋白包含至少一个T辅助细胞表位，所述载体蛋白可 以增强所述抗原蛋白的免疫原性。
[0016] 在另一优选例中，所述载体蛋白选自：乙肝核心抗原（HepatitisBcore antigen)、白喉毒素DT、白喉毒素的跨膜结构域DTT、霍乱毒素B亚单位（CTB)、沙门氏菌鞭 毛蛋白（FliC)、百日咳毒素（PTX)、破伤风毒素、或上述蛋白的免疫原性片段（如破伤风毒 素的C片段）。
[0017] 在另一优选例中，所述乙肝核心抗原（HepatitisBcore antigen)序列如SEQID NO. : 2所示。
[0018] 在另一优选例中，通过替换和/或插入将所述引入所述载体蛋白形成所述融合蛋 白。
[0019] 在另一优选例中，通过将所述抗原表位肽连接于所述载体蛋白的C末端或N末端 形成融合蛋白。
[0020] 所述抗原表位和所述载体蛋白之间具有连接肽。优选地，所述连接肽长度为3-30 个氨基酸。更优选地，所述连接肽长度为4-20个氨基酸。最优选地，所述连接肽长度为5-10 个氨基酸。
[0021] 在另一优选例中，所述抗原表位和所述载体蛋白之间不具有连接肽。
[0022] 在另一优选例中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO. : 3所示。
[0023] 本发明的第三方面，提供了一种结合分子，所述结合分子能可特异性结合第一方 面所述的的抗原表位肽或第二方面所述的融合蛋白。
[0024] 在另一优选例中，所述结合分子是抗体。
[0025] 在另一优选例中，所述抗体是单克隆抗体。
[0026] 本发明的第四方面，提供了一种分离的核酸分子，它编码本发明第一方面的抗原 表位肽或本发明第二方面所述的融合蛋白。
[0027] 本发明的第五方面，提供了一种组合物，它含有：
[0028] (a)本发明第一方面所述的抗原肽或其药学上可接受的盐、或本发明第二方面所 述的融合蛋白；和
[0029](b)药学上可接受的载体或赋形剂。
[0030] 在另一优选例中，所述所述的组合物包括药物组合物和疫苗组合物。
[0031] 在另一优选例中，所述药学上可接受的载体包括铝佐剂、MF59、弗氏完全佐剂、弗 氏不完全佐剂、CpG佐剂、卡介菌核糖核酸、单磷酰脂A。
[0032] 本发明的第六方面，提供了本发明第一方面所述的抗原肽、第二方面的融合蛋白 或第三方面的结合分子的用途，用于制备检测手足口病病毒的试剂或试剂盒；或
[0033] 用于制备预防或治疗手足口病病毒感染的药物；或
[0034] 用于检测抗手足口病病毒的抗体。
[0035] 在另一优选例中，所述手足口病病毒包括肠道病毒和/或柯萨奇病毒。
[0036] 在另一优选例中，所述手足口病病毒包括肠道病毒71型（Enter〇Virus71，EV71) 和/或柯萨奇病毒A16型。
[0037]本发明的第七方面，提供了一种免疫检测试剂盒，所述试剂盒包括本发明第一方 面所述的抗原表位肽、第二方面的融合蛋白和/或第三方面的结合分子。
[0038] 本发明的第八方面，提供了一种制备本发明第二方面所述融合蛋白的方法，包括 步骤：
[0039] (1)构建表达质粒
[0040] 所述表达质粒中含有编码所述融合蛋白的核酸序列；
[0041] (2)融合蛋白的表达；
[0042] 将所述质粒转入大肠杆菌BL21的感受态细胞进行表达。
[0043] 本发明的第九方面，提供了一种预防手足口病的方法，向所需要的对象施用本发 明的疫苗组合物。
[0044] 在另一优选例中，所述的需要的对象包括哺乳动物，较佳地，为人、小鼠、大鼠、兔。
[0045] 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文（如实施例）中具 体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附图说明】
[0046] 图1显示了HBcPEP71在E.coli中的表达。
[0047] 图2显示了纯化后HBcPEP71蛋白的SDS-PAGE检测结果。
[0048] 图3显示了HBcPEP71嵌合病毒样颗粒的组装。
[0049] 图4显示了HBcPEP71免疫小鼠血清对CA16的中和活性。
[0050] 图5显示了HBcPEP71免疫血清的体内保护效果。
【具体实施方式】
[0051] 本发明人通过广泛而深入的研究，设计和构建了CA16中和表位PEP71与乙肝核心 抗原（HepatitisBcoreantigen,HBc)融合蛋白的表达载体，并在大肠杆菌中表达该融合 蛋白，命名为HBcPEP71。生化试验和电镜分析证明，纯化的HBcPEP71自发组装成展示PEP71 表位的嵌合病毒样颗粒。HBcPEP71嵌合病毒样颗粒免疫小鼠血清能够与PEP71多肽结合， 表明抗血清中存在针对PEP71的抗体，而且该抗血清能够在体外中和CA16病毒、在体内保 护初生小鼠免于CA16病毒的致死感染。意外的是，本发明人发现HBcPEP71免疫血清还能 够在体外结合EV71病毒颗粒并抑制EV71感染。以上结果显示HBcPEP71病毒样颗粒是兼 抗EV71和CA16的基因工程疫苗。
[0052] 活性多肽
[0053] 如本文所用，术语"抗原表位肽"、"抗原肽"、"活性多肽"、"多肽抗原"可互换使用。 指多肽序列来自于柯萨奇病毒（如CA16)的多肽。这些抗原表位肽可结合于抗柯萨奇病毒 抗体。与载体蛋白融合后形成的重组蛋白能够诱发机体抗柯萨奇病毒的免疫反应。此外， 所述术语还包括具有结合抗柯萨奇病毒的抗体功能的、SEQIDNO:1所示序列的变异形式。 这些变异形式包括（但并不限于）：1-3个（通常为1-2个，更佳地1个）氨基酸的缺失、插 入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个（通常为3个以内，较佳 地为2个以内，更佳地为1个以内）氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基 酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一 个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的结构和功能。此外，所述术语还包括单体和多聚 体形式的本发明多肽。该术语还包括线性以及非线性的多肽（如环肽）。
[0054] 本发明还包括柯萨奇病毒抗原肽的活性片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语 "片段"、"衍生物"和"类似物"是指基本上保持与抗柯萨奇病毒