一条与乙脑病毒e蛋白相结合的多肽及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于病毒检测领域，主要涉及一种乙脑病毒E蛋白相结合的多肽及其应 用。
【背景技术】
[0002] 流行性乙型脑炎病毒简称乙脑病毒，它是流行性乙型脑炎的病原体。该病毒为单 链RNA，外层具包膜，包膜表面有血凝素。幼猪是乙脑病毒的主要传染源和中间宿主，蚊子是 乙脑病毒的传播媒介。当人受带病毒的蚊子叮咬后，乙脑病毒进入人体，在血管内皮细胞、 淋巴结、肝、脾等吞噬细胞内增殖，并经血液循环到达脑部而引起炎症。病毒核心部分有核 心蛋白C和RNA组成，外膜部分中有糖基化蛋白E和非糖基化蛋白M，向表面突起，具有血凝 素活性。E蛋白是病毒主要抗原成分，它具有特异性的中和及血凝功能抗原的决定簇，M和 C蛋白虽然也有抗原性，但在致病机制方面所起的作用不大。
[0003] 噬菌体展示技术是当前研究多肽与蛋白质作用的一种有效手段。这一技术将多肽 的编码序列克隆到噬菌体壳蛋白的合适位置，并且要保证其正确的翻译序列，也不影响噬 菌体壳蛋白的正常功能，这样噬菌体表达的壳蛋白结构中将会存在外源多肽的序列；伴随 着噬菌体子代的重新组装，外源多肽序列将展示在噬菌体的表面。在一般情况下，外源展示 的多肽具备一定的空间结构和生物活性，可以与相应的靶分子进行结合。展示肽库与靶蛋 白分子结合后，洗去未结合的噬菌体，然后将与靶分子结合的噬菌体洗脱下来感染细胞扩 增，经过3轮到6轮的"吸附-洗脱-扩增"，噬菌体与靶分子的结合特异性将逐步提高；经 过多次筛选之后，最终可以筛选到与靶分子相结合的高亲和噬菌体。
【发明内容】
[0004] 本发明借助噬菌体肽库展示技术，利用表达纯化的乙脑E蛋白进行多轮筛选，最 终得到可特异结合乙脑E蛋白的多肽克隆株，挑选其克隆株进行序列测定，其多肽序列为 HRHHV;人工合成此多肽进行ELISA结合实验，结果证明，人工合成的多肽与乙脑病毒E蛋白 有良好的结合能力。借助本发明的多肽，可用于对乙脑抗原进行定量和定性的检测。
[0005] 本发明的技术方案： 一条可与乙脑病毒E蛋白结合的多肽，所述多肽的氨基酸序列为HRHHV。
[0006] 所述多肽为线性结合多肽。
[0007] 编码权利要求1或2所述的多肽的核苷酸序列。
[0008] 以所述的多肽为核心，任何对此多肽序列的延长和修饰，修饰材料包括但不局限 于纳米材料、荧光材料、酶类、生物素及特定的蛋白质。
[0009] 将所述多肽用于乙脑的抗原检测，其中包括但不局限于酶联免疫反应和放射免疫 测定及其形成的免疫学试纸检测、westernblot检测、ELISA检测等检测方法及产品。
[0010] 所述的多肽在用于对乙脑抗原进行定量和定性检测中的应用。
[0011] 本发明的积极有益效果： (1)本发明借助噬菌体肽库筛选技术，利用表达纯化的乙脑E蛋白进行多轮筛选，最终 得到可特异结合乙脑E蛋白的多肽克隆株。挑选其克隆株进行序列测定，其多肽的核心序 列为HRHHV;人工合此多肽进行ELISA结合实验，结果证明，此人工合成的多肽可与乙脑病 毒E蛋白有很好的结合；其亲和力可达4. 96XIO9LAioI。
[0012] (2)由于病毒难以纯化，因此针对病毒的抗体获得非常不易，本发明设计合成的多 肽很好地规避了这一难题，可利用人工合成方法快速取得，检测成本也非常低廉。
[0013] (3)本发明的人工合成多肽与人工接种JEV、人工表达JEVE蛋白均可以结合，而 且与其它病毒蛋白均不反应，特异性较高。
[0014] (4)本方法较人工表达蛋白再进行免疫获得蛋白抗体的过程简便，更易操作；通过 对多肽进行标记，可快速地对乙脑E蛋白进行定性和定量检测。
【附图说明】
[0015] 图1 :利用多肽测定培养乙脑病毒、表达蛋白的结果。
[0016] 图中横坐标上，1为乙脑病毒接种PK15细胞，2为表达乙脑病毒E蛋白，3为PK15 细胞对照；纵坐标为OD值。
[0017] 图2:利用本发明的多肽与其它病毒交叉反应的结果。
[0018] 图中横坐标为不同包被ELISA板细胞培养物的各类病毒；纵坐标为OD值。
[0019] 图3利用本发明多肽测定JEVE蛋白的标准曲线。
【具体实施方式】
[0020] 实例1噬菌体随机肽库的筛选 用纯化表达的乙脑病毒E蛋白（JEVE蛋白）包被聚氯乙烯板，每孔IOOyl(IOOyl/ml)包被，置于4°C条件下过夜，用PBST洗涤后再用5%的BSA液封闭； 将稀释后的噬菌体肽库IOOyl(约含噬菌体2X10npfu))加入到相应的孔中，室温 条件下孵肓2h，用TBST液冲洗8-10次，每孔加入洗脱液200yI(TBST缓冲液，含50mM Tris-HClpH7. 5,150mMNaCl，0.2% 的Tween-20)，室温条件下振荡 5-8min，吸出洗脱液并 中和至中性； 中和后的洗脱液可以用于滴度测定和下一轮培养(在LB-Tet培养基上挑取单菌落于 5~10mL的LB培养液中，37°C震荡培养至对数期（OD6m=O. 5));将LB培养后的噬菌体进行 离心收集，用于下一轮的筛选。（用灭菌的TBS溶液10倍系列稀释洗脱液。建议的稀释范 围是：测定未扩增的淘选洗脱液为lO^lO4,扩增后的洗脱液为l〇s~l〇n。当菌体达到对数 期时，分200yL等份于青霉素小瓶中，每个菌体稀释度一瓶，每瓶中IOiiL的不同稀释 度的噬菌体，快速震荡混匀形成受噬菌体感染的细菌)。
[0021] 不同筛选轮次的噬菌体富集鉴定见表1，洗脱液的滴度测定结果见表2。
[0022] 表1每轮亲和筛选中噬菌体的量
实例2筛选多肽的鉴定 (1) 将接种的乙脑病毒的PK15细胞培养液进行超声破碎，然后以2yg/ml(蛋白量计） 进行ELISA板包被；以同样方式将人工表达的乙脑病毒E蛋白和未接种病毒的PK15做为对 照进行包被；在进行特异性试验时，将不同病毒蛋白进行包被； (2) 将人工合成多肽的HRHHV偶联辣根过氧化物酶(采用商业化偶联试剂盒偶联)，将偶 联产物加入上述ELISA板中，每孔50y1，浓度为lOOng/ml，加入到上述ELISA板中，震荡器 上混匀，37°C条件下避光孵育30min; (3) 用酶标板洗板机洗6次，或手工甩掉酶标板孔中的液体，用稀释后的缓冲液加满各 孔，再甩干，如此重复洗涤6次； (4) 根据所需用量将TMB液加入到相应的微孔中，每孔加100y1，在酶标板震荡器上震 荡30秒，室温（23±3°C) 10分钟充分显色； (5) 每孔加入50yl2M的硫酸液终止反应，在酶标板震荡器上震荡30秒，然后用酶标 仪读取各孔在450纳米处的吸光值，判定结果。
[0023] 结果表明，人工合成多肽与人工接种JEV、人工表达JEVE蛋白均可以结合(见图 1)，而且与其它病毒蛋白均不反应，其特异性较高(见图2)。
[0024] 实例3筛选多肽的亲和力鉴定 (1) 将接种的乙脑病毒的PK15细胞培养液进行超声破碎，然后以2yg/ml(蛋白量计） 进行ELISA板包被；以同样方式将人工表达的乙脑病毒E蛋白和未接种病毒的PK15做为对 照进行包被。在进行特异性试验时，将不同病毒蛋白进行包被； (2) 将人工合成多肽HRHHV偶联辣根过氧化物酶，不同浓度的酶标记多肽加入到上述 ELISA板中50y1，震荡器上混匀，37°C条件下避光孵育30min; (3) 用酶标板洗板机洗6次，或手工甩掉酶标板孔中的液体，用稀释后的缓冲液加满各 孔，再甩干，如此重复洗涤6次； (4) 根据所需用量将TMB液加入到相应的微孔中，每孔加100y1，在酶标板震荡器上震 荡30秒，室温（23±3°C) 10分钟充分显色； (5) 每孔加入50yl2M的硫酸液终止反应，在酶标板震荡器上震荡30秒，然后用酶标 仪读取各孔在450纳米处的吸光值，判定结果。
[0025] 最终利用Scatchard方程分析，不同加入酶标多肽的浓度来计算多肽与病毒的亲 和力常数，其中Ka=[结合物]/[抗原][多肽]，(其中[结合物]是指多肽与抗原相结合的 浓度，[抗原]是指抗原浓度，[多肽]是指未结合的多肽浓度)。通过计算可知本发明多肽 与E2蛋白的亲和力常数可达4. 96XIO9LAioI，说明其亲和力比较好。
[0026] 实例4JEVE蛋白的定量测定 (1)将接种的乙脑病毒的PK15细胞培养液进行超声破碎，然后以2yg/ml(蛋白量计） 进行ELISA板包被； (2)将不同浓度的JEVE蛋白加入到微量孔中（浓度分别为0.5、I、2、4、8、16yg/ml)，将人工合成多肽的HRHHV偶联辣根过氧化物酶(采用商业化偶联试剂盒偶联)，将偶联产物 加入上述ELISA板中，每孔50y1，浓度为100ng/ml，加入到上述ELISA板中，震荡器上混 匀，37°C条件下避光孵育30min; (3) 用酶标板洗板机洗6次，或手工甩掉酶标板孔中的液体，用稀释后的缓冲液加满各 孔，再甩干，如此重复洗涤6次； (4) 根据所需用量将TMB液加入到相应的微孔中，每孔加100y1，在酶标板震荡器上震 荡30秒，室温（23±3°C) 10分钟充分显色； (5) 每孔加入50yl2M的硫酸液终止反应，在酶标板震荡器上震荡30秒，然后用酶标 仪读取各孔在450纳米处的吸光值，判定结果。
[0027] (6)标准曲线绘制：以JEVE蛋白的浓度对数值为X轴，以选定浓度的吸光值/阳 性值的强光值的百分率为Y轴，绘制各个浓度的点，并计算其标准曲线方程(见图3)。
【主权项】
1. 一条可与乙脑病毒E蛋白结合的多肽，其特征是，所述多肽的氨基酸序列为HRHHV。2. 根据权利要求1所述的多肽，其特征是，所述多肽为线性结合多肽。3. 编码权利要求1或2所述的多肽的核苷酸序列。4. 根据权利要求1所述的多肽，其特征是，包括以所述的多肽为核心，任何对此多肽序 列的延长和修饰，修饰材料包括但不局限于纳米材料、荧光材料、酶类、生物素及特定的蛋 白质。5. 根据权利要求1所述的多肽，其特征是，将所述多肽用于乙脑的抗原检测，其中包 括但不局限于酶联免疫反应、放射免疫测定、免疫学试纸检测、western blot检测和ELISA 检测。6. 根据权利要求1-5任一项所述的多肽在用于对乙脑抗原进行定量和定性检测中的 应用。
【专利摘要】本发明主要涉及乙脑病毒E蛋白结合多肽及其应用，该多肽序列为HRHHV，是一种线性结合多肽，以多肽序列为核心，可以对此多肽序列进行延长和修饰，修饰材料包括但不局限于纳米材料、荧光材料、酶类、生物素及特定蛋白质。本发明借助噬菌体肽库筛选技术，利用表达纯化的乙脑E蛋白进行多轮筛选，最终得到可特异结合乙脑E蛋白的多肽克隆株；挑选其克隆株进行序列测定，其多肽的核心序列为HRHHV；人工合成此多肽进行ELISA结合实验，结果证明此合成多肽能与乙脑病毒E蛋白很好的结合；本发明较人工表达蛋白再进行免疫获得蛋白抗体的过程简便，更易操作；通过对多肽进行标记，可快速地对乙脑E蛋白进行定性和定量检测。
【IPC分类】C07K7/06, G01N33/68
【公开号】CN105085621
【申请号】CN201510496005
【发明人】樊剑鸣, 张晓峰, 冯斐斐, 胡梦华, 张巧
【申请人】郑州大学
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2015年8月14日