柯萨奇病毒ca16 vp1重组抗原及其单克隆抗体与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一组柯萨奇病毒A16型（CA16)VP1重组抗原及其单克隆抗体与应用， 属于分子生物学技术领域。
【背景技术】
[0002] 手足口病（Handfootmouthdisease，HFMD)是由肠道病毒引起的一种全球性常 见的急性传染病。该病多发生于5岁以下儿童，主要表现为口痛、厌食、低热、手、足、口腔等 部位出现小疱瘆或小溃疡，少数患儿可引起心肌炎等并发症。个别重症患儿病情发展快，导 致死亡。手足口病是由肠道病毒引起的传染病，引发手足口病的肠道病毒有20多种（型）。 目前国内爆发的手足口病以柯萨奇病毒A16型（CA16)和肠道病毒71型（EV71)引起最为 常见。以往研宄多认为CA16引起的手足口病一般症状较轻，致使CV16的研宄未能引起足 够的重视，但其容易在儿童群体中引起暴发性流行。如果同时感染CA16和EV71，20%患者 可能出现重症炎症及伤害中枢系统造成后遗症。基于此，早发现CA16可有效降低该病毒传 播风险，并有助于患者得到及时治疗。因此，研制CA16病毒检测试剂显得尤为重要。
[0003] 柯萨奇病毒A16型是人类最早发现的柯萨奇A组病毒，1951年在南非被成功分离。 该病毒基因组为单股正链RNA，全长约7410个核苷酸，基因组含一个开放读码框，编码一个 多聚前体蛋白。该蛋白可进一步被水解成P1、P2、P3等3个前体蛋白。其中P1蛋白可分解 为VP1、VP2、VP3和VP4四个外壳蛋白。VP1、VP2、VP3暴露在病毒衣壳蛋白的表面，具有大 量抗原决定簇，而其中的VP1最主要的衣壳蛋白，其长度89lbp，编码297个氨基酸残基，具 有最多的特异性中和位点，因此，VP1蛋白的编码基因序列与病毒血清具有较高的相关性， 常被用于病毒的鉴定和进化分析。
[0004] 高相关的柯萨奇CA16VP1重组抗原及其单克隆抗体是手足口病检测试剂制备的 关键。近年来，基因工程的发展为研制CA16VP1特异性抗原和单克隆抗体提供了良好基 础。故加强研制新型柯萨奇CA16VP1重组抗原及其单克隆抗体，对开发更加有效的早期诊 断CA16病毒的方法和试剂盒具有重要意义。
【发明内容】
[0005] 本发明目的在于提供一组柯萨奇病毒A16型（CA16)VP1重组抗原及其单克隆抗体 与应用。
[0006] 本发明所述的一组柯萨奇病毒A16型（CA16)VP1重组抗原，其特征在于：所述重组 抗原由SEQIDNo. 1~SEQIDNo. 8所示的8种氨基酸序列分别与柔性短肽氨基酸序列连 接制得；其中，所述柔性短肽氨基酸序列是：GGGGS或GGGGSGGGGSGGGGS或AAY，所述8种氨 基酸序列分别与柔性短肽氨基酸序列连接时，每种氨基酸序列均重复3次。
[0007] 进一步的，所述重组抗原为8种，其编号分别为CA16VP1 1号~CA16VP1 8号，其 中CA16VP1 1号~CA16VP1 8号重组抗原的核苷酸序列分别依次如SEQIDNo. 9~SEQ IDNo. 16 所示。
[0008] 基于本发明人多年对全国不同疫区的病毒的研宄，综合阅读国内外有关CA16文 献，本申请选择CA16的VP1蛋白作为抗原靶位的主要研宄对象。通过多种生物信息学数据 库及生物信息学软件对VP1基因及其编码蛋白序列对比分析，考虑氨基酸序列亲水性，对 VP1抗原表位预测，筛选得到CA16病毒8种潜在高交叉反应性的线性亲水表位氨基酸序列， 合成基因重组表达，并经过实验验证具有高交叉反应，其氨基酸序列为：
[0009] VP1(1-15AA)SEQ ID N01 :⑶PIADMIDQTVNNQ
[0010] VP1(26-40AA)SEQ ID N02 ：LPTAANTEASSHRLG
[0011] VP1(47-61AA)SEQ ID N03 ：LQAAETGASSNASDK
[0012] VP1(94-108AA)SEQ ID N04 ：TMPTTGTQNTDGYVN
[0013] VP1(156-177AA)SEQ ID N05 ：VPPGAPKPTSRDSFAWQTATNP
[0014] VP1(183-199AA)SEQ ID N06 ：MTDPPAQVSVPFMSPAS
[0015] VP1(208-228AA)SEQ ID N07 ：YPTFGEHLQANDLDYGQCPNN
[0016] VP1(274-293AA)SEQ ID N08 ：KTNPNYKGNDIKCTSTSRDK
[0017] 利用基因重组方法，将上述各线性表位序列分别加入柔性短肽连（GGGGS或 GGGGSGGGGSGGGGS或AAY)接在一起，可以获得具有高交叉反应的融合VP1抗原，即柯萨奇病 毒A16型（CA16)VP1重组抗原。
[0018] 本发明还提供了一组抗体，其特征在于：所述抗体是能分别与上述柯萨奇病毒 A16型（CA16)VP1重组抗原特异性结合的单克隆抗体。
[0019] 分别将上述表达纯化的柯萨奇病毒A16型（CA16)VP1重组抗原，利用常规单克隆 抗体制备方法免疫小鼠（注射小鼠），然后经纯化分离即得到分别与上述重组抗原特异性 结合的单克隆抗体。本发明并通过ELISA进行两两配对的组合实验，获得了 4组有效组合。
[0020] 本发明所述柯萨奇病毒A16型（CA16)VP1重组抗原在制备A16型柯萨奇病毒抗原 或抗体检测试剂盒中的应用。
[0021] 本发明所述柯萨奇病毒A16型（CA16)VP1重组抗原可以用于开发体外检测样品中 是否存在抗CA16病毒抗体的试剂盒或作为其他CA16检测产品的重要原料，或者可以用于 开发体外检测样品中是否存在CA16病毒抗原的试剂盒或作为其他CA16检测产品的重要原 料。对开发更加有效的早期诊断CA16的方法和试剂盒提供了基础。
[0022] 与现有技术比，本发明技术具有以下特点：
[0023] 1.筛选得到的VP1抗原是线性亲水表位，易于与患者血清中抗CA16病毒抗体发生 特异性结合反应。运用本发明的特异性重组蛋白可用于免疫于兔、鼠等动物，制备单克隆抗 体。
[0024] 2.本发明得到的单克隆抗体可以通过本领域技术人员已知的各种技术进行制备 (如杂交瘤技术），亦可以通过小抗体技术制备Fab段。
[0025] 3.本发明的重组抗原蛋白和抗体是高特异性、高灵敏度的优质生物原料，均可以 直接用于检测人血清中CA16病毒或抗CA16抗体，从而有利于CA16病毒感染早期筛查。
【具体实施方式】
[0026] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明范围。若未特别指明，实施例中 所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
[0027] 实施例1 :候选抗原表位的选择
[0028]通过查找NCBI(美国国立生物技术信息中心，http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)， 对CA16的共51条CA16序列进行分析，根据氨基酸序列的同源性，依次分筛选出8条各基 因型序列保守的线性表位抗原序列。其氨基酸序列分别如表1所示。
[0029] 表1本发明所述CA16VP1线性抗原表位序列
【主权项】
1. 一组柯萨奇病毒A16型（CA16)VP1重组抗原，其特征在于：所述重组抗原由SEQID No. 1~SEQIDNo. 8所示的8种氨基酸序列分别与柔性短肽氨基酸序列连接制得；其中， 所述柔性短肽氨基酸序列是：GGGGS或GGGGSGGGGSGGGGS或AAY，所述8种氨基酸序列分别 与柔性短肽氨基酸序列连接时，每种氨基酸序列均重复3次。
2. 如权利要求1所述的柯萨奇病毒A16型（CA16)VP1重组抗原，其特征在于：所述重 组抗原有8种，其编号分别为CA16VP1 1号~CA16VP1 8号，其中CA16VP1 1号~CA16 VP1 8号重组抗原的核苷酸序列分别依次如SEQIDNo. 9~SEQIDNo. 16所示。
3. -组抗体，其特征在于：所述抗体是能分别与权利要求2所述柯萨奇病毒A16型 (CA16)VP1重组抗原特异性结合的单克隆抗体。
4. 权利要求1或2所述柯萨奇病毒A16型（CA16)VP1重组抗原在制备A16型柯萨奇病 毒抗原或抗体检测试剂盒中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一组柯萨奇病毒A16型(CA16)VP1重组抗原，是由SEQ ID No.1～SEQ ID No.8所示的8种氨基酸序列分别与柔性短肽氨基酸序列连接制得。本发明还公开了能与所述CA16VP1重组抗原特异性结合的单克隆抗体，以及所述重组抗原在制备A16型柯萨奇病毒抗原或抗体检测试剂盒中的应用。本发明提供的8个重组抗原和4组单克隆抗体具有高灵敏度、高特异性等特点，是可以作为研制柯萨奇CA16病毒检测试剂的关键原料。
【IPC分类】C07K16-10, G01N33-569, G01N33-68, C07K19-00
【公开号】CN104710537
【申请号】CN201510165697
【发明人】汪运山
【申请人】汪运山
【公开日】2015年6月17日
【申请日】2015年4月9日