重组人g-csf二聚体及其在治疗神经系统疾病中的用图
【专利说明】
[0001] 本申请是申请日为2011年05月25日、申请号为201180025773.X、发明名称为"重 组人G-CSF二聚体及其在治疗神经系统疾病中的用途"的发明专利申请的分案申请。
[0002] 相关申请的交叉引用
[0003] 根据35U.S.C. § 119(a)，本申请要求2010年5月25日提交的中国专利申请（申 请号CN201010181623. 5)的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
[0004] 序列表引用
[0005] -起提交的序列表硬拷贝（hardcopy)和相应的计算机可读形式，其全部内容通 过引用并入本文。
技术领域
[0006] 本发明涉及生物学和医学技术领域，特别地，本发明涉及一种新的人G-CSF二聚 体及其在治疗伴随神经损伤的疾病中的用途。
【背景技术】
[0007] 人粒细胞集落刺激因子（G-CSF)是一种含有204个氨基酸和30个氨基酸信号肽 的糖蛋白。成熟的G-CSF蛋白分子量为18-20kDa，由174个氨基酸构成，不含信号肽，并被 分泌到细胞外。主要负责这类分泌的人类细胞为单核细胞、成纤维细胞、和内皮细胞。
[0008] G-CSF主要具有三大生物学功能，即：
[0009] 1.作用于骨髓前体细胞和干细胞，从而驱动嗜中性粒细胞的分化、发育和成熟；
[0010] 2.激活成熟的嗜中性粒细胞，参与免疫反应；和
[0011] 3.作用于其他造血生长因子，如干细胞因子、Flt-3配体、和GM-CSF，从而动员造 血干细胞。
[0012] G-CSF受体（G-CSFR)已证实存在于骨髓造血干细胞Sca+LirTThl1?、前体细胞 0)34+、以及定向分化的嗜中性粒前体细胞（committedgranulocyteprecursor)、和成熟的 嗜中性粒细胞。G-CSFR是一种对G-CSF有高亲合力的特异性受体，具有812个氨基酸。
[0013] 1&1^(1&等人获得了6-05? :6-05?1?复合物的晶体结构，2.8埃衍射分析（?嫩5， 2008，V〇1. 103:3135-3140)显示G-CSF:G-CSFR复合物是以2 :2比例存在。换言之，每个复 合物中，每一个G-CSF结合于一个受体链，从而形成G-CSF-受体复合物，当两个G-CSF-受 体复合物相互靠近，相互作用形成2:2二聚体。在这种情况下，G-CSF受体的羧基端才能激 活下游的信号分子JAK2(Janustyrosinekinase，主要是JAK2)。因此，JAK2激活STAT3， 从而启动对嗜中性粒细胞分化、增殖和激活至关重要的基因的转录。
[0014] 2003年，SchabitzW.R等报道，重组人G-CSF(rhG-CSF)对神经细胞在缺血性动物 模型中具有保护功能（Stroke，2003, 34:745-751)。2006年后期，Shyu等报道，连续5天每 天给病人施用重组人G-CSF，表明，rhG-CSF在急性中风病人的治疗中具有临床效果（CMAJ， 2006,174:927-933)。皮下给药，鼠G-CSF在体内的半衰期约2小时，而人G-CSF的皮下给 药半衰期只有3. 5小时，因此，需要给需要的病人每天施用，或静脉注射药物，这会影响病 人的生活质量。
【发明内容】
[0015] 鉴于前述背景，本发明的目的是提供一种用于更有效治疗伴随神经损伤的疾病的 替代药物及其制法。
[0016] 因此，在本发明的第一方面，提供了一种式I所示的G-CSF二聚体：
[0017] (I) M1-L-M2
[0018] 其中，Ml是G-CSF的第一单体；M2是G-CSF的第二单体；L是连接所述第一单体和 第二单体的接头（1inker)，并位于所述第一单体和第二单体之间。
[0019] 并且，所述的G-CSF二聚体保持G-CSF单体的生物活性，并且其血清半衰期是所述 第一或第二单体的2倍以上。
[0020] 在本发明的一个优选例中，所述的L选自下组：
[0021] a)有机接头；
[0022] b)包含3-50个氨基酸的短肽；以及
[0023] c)式II所示的多肽：
[0024] (II) -Z-Y-Z-
[0025] 其中，Y为载体蛋白；Z为包含0-30个氨基酸的短肽。在另一优选例中，没有氨基 酸的短肽是指肽健。
[0026] 在另一优选例中，接头对G-CSF二聚体具有足够小的空间位阻，以至于不影响或 不显著影响第一单体和第二单体形成的正确的折叠和构象。
[0027] 在一个优选例中，有机接头选自下组：氧甲基苯基乙酰胺基甲基 (oxymethylphenylacetamidomethyl) (PAM)树脂、4_氧甲基-苯基乙酰胺基甲基树脂 (4-oxymethylphenylacetamidomethylresin)、和氯甲基化聚苯乙稀树脂（chloromethyl polystyreneresin)〇
[0028] 在另一优选例中，所述的第一单体和第二单体是相同的。
[0029] 在一个优选例中，所述融合蛋白的生物活性包括：
[0030] (a)作用于嗜中性粒细胞和干细胞，从而驱动嗜中性粒细胞的分化、生长和成熟； 和
[0031] (b)激活成熟的嗜中性粒细胞，参与免疫反应。
[0032] 在另一优选例中，所述的载体蛋白是白蛋白或人IgG的Fc片段。
[0033] 在一个优选例中，所述的G-CSF二聚体的血清半衰期是所述第一和/或第二单体 血清半衰期的3倍以上、5倍以上、或10倍以上。
[0034] 在另一优选例中，所述的G-CSF二聚体由两个G-CSF-Fc复合物制得，其中，每个 G-CSF-Fc复合物包含一个选自SEQIDN0:2-7的氨基酸序列。
[0035] 在本发明的另一方面，提供了一种由第一多肽和第二多肽制备的融合蛋白，其中， 所述的第一多肽和第二多肽包含一段如SEQIDN0:8所示的氨基酸序列，且两个多肽无空 间位阻地连接。
[0036] 在一个优选例中，所述的第一和第二多肽为G-CSF单体。
[0037]在本发明的另一优选例中，所述的第一多肽和第二多肽之间的无位阻地连接通过 接头实现。在该实施例中，所述的接头为：
[0038] a).具有足够小空间位阻的有机接头，不影响或不显着影响第一单体和第二单体 形成的正确的折叠和构象；
[0039] b).包含3-50个氨基酸的短肽；以及 [0040]c) ?式II所示的多肽：
[0041] (II) -Z-Y-Z-
[0042] 其中，Y为载体蛋白；Z为包含0-30个氨基酸的短肽。在一个优选例中，所述的没 有氨基酸的短肽是指肽健。
[0043] 在另一优选例中，所述的有机接头为：氧甲基苯基乙酰胺基甲基 (oxymethylphenylacetamidomethyl) (PAM)树脂、4_氧甲基-苯基乙酰胺基甲基树脂 (4-oxymethylphenylacetamidomethylresin)、和氯甲基化聚苯乙稀树脂（chloromethyl polystyreneresin)〇
[0044] 在本发明的另一方面，提供了一种包含以由两个G-CSF-Fc复合物制得的纯化的 G-CSF二聚体作为活性成分的药物组合物，其中，每个G-CSF-Fc复合物包含一段选自SEQ IDN0:2-7的氨基酸序列。在另一优选例中，所述的G-CSF二聚体的纯度为90-100%;在另 一优选例中，所述的G-CSF二聚体的纯度为95-100% ;在另一优选例中，所述的G-CSF二聚 体的纯度为99-100%。
[0045] 在该特定方面的一个优选例中，提供了一种治疗神经系统疾病（neurological disorder)的方法，包括：给需要治疗的对象施用有效量的前述的药物组合物。在另一优选 例中，所述的有效量为〇.〇〇l-l〇〇〇mg二聚体每剂。在另一优选例中，所述的疾病选自下组： 中风、脊柱损伤、以及伴随着血脑屏障损伤的神经系统疾病。
[0046] 在该特定方面的另一优选例中，提供了一种激活神经细胞中STAT3的方法，包括： 给需要治疗的对象施用有效量的前述的药物组合物。在另一优选例中，所述的有效量为 0. 001-1000mg二聚体每剂。
[0047] 在本发明的另一方面，提供了一种分离的包含如SEQIDNO:2-7任一所示的氨基 酸序列的多肽。在一个实施例中，提供了一种以包含如SEQIDN0:2-7任一所示的氨基 酸序列的纯化的多肽作为活性成分的药物组合物。在一个优选例中，所述多肽的纯度为 90-100% ;在另一优选例中，所述多肽的纯度为95-100% ;在另一优选例中，所述多肽的纯 度为 99-100%。
[0048] 在该特定方面的一个优选例中，提供了一种治疗神经系统疾病的方法，包括：给需 要治疗的对象施用有效量的前述的药物组合物。在另一优选例中，所述的疾病选自下组：中 风、脊柱损伤、以及伴随着血脑屏障损伤的神经系统疾病。
[0049] 在该特定方面的另一优选例中，提供了一种激活神经细胞STAT3的方法，包括：给 需要治疗的对象施用有效量的前述的药物组合物。
[0050] 在本发明的另一方面，提供了本发明所述人粒细胞集落刺激因子（G-CSF)二聚体 或本发明分离的多肽在制备治疗神经系统疾病药物中的用途。
[0051] 在在该特定方面的另一优选例中，所述的疾病选自下组：中风、脊柱损伤、以及伴 随着血脑屏障损伤的神经系统疾病。
[0052] 在本发明的另一方面，提供了人粒细胞集落刺激因子（G-CSF)二聚体或本发明的 分离的多肽在制备用于刺激神经细胞STAT3的组合物中的用途。
[0053] 在本发明