），连接所述G-CSF单体和所述Fc片段的肽（第175-190位氨基酸残基）。与SEQID N0:2相比，SEQIDN0:6删除了短序列ERKCC，因此除去了两个二硫键，从而减少了铰链的 错配。二个G-CSF-Fc复合物带有Fc片段，通过Fc片段的配对构成二聚体。在一个实施例 中，所述Fc片段通过所述的Fc片段的多个二硫健配对；在另一个实施例中，所述的二硫键 的数量为2或4。
[0093]SEQIDNO: 7表示构成G-CSF二聚体的G-CSF-Fc复合物，如图3a和图3b所示，其 包含一个G-CSF单体（第240-413位氨基酸残基），人IgG2的Fc片段（第1-223位氨基酸 残基），连接所述G-CSF单体和所述Fc片段的肽（第224-239位氨基酸残基）。与SEQID NO:3相比，SEQIDNO:7删除了短序列ERKCC，因此除去了两个二硫键，从而减少了铰链的 错配。二个G-CSF-Fc复合物带有Fc片段，通过Fc片段的配对构成二聚体。在一个实施例 中，所述Fc片段通过所述的Fc片段的多个二硫健配对；在另一个实施例中，所述的二硫键 的数量为2或4。
[0094]SEQIDNO:8 表示G-CSF单体分子。
[0095]SEQIDNO:9 表示SEQIDNO:2 的DNA序列。
[0096]SEQIDNO: 10 表示SEQIDNO:6 的DNA序列。
[0097] 制备方法
[0098] 编码本发明G-CSF二聚体或融合蛋白的DNA序列，可以全部人工合成。或者，也可 用PCR扩增或合成获得第一G-CSF单体和/或第二G-CSF单体的DNA编码序列，然后将其 连接在一起，形成本发明G-CSF二聚体或融合蛋白的DNA编码序列。
[0099] 为了提高宿主细胞的表达量，可以对G-CSF二聚体编码序列进行改造。例如可以 采用宿主细胞偏好的密码子，消除不利于转录及翻译的序列。在一个优选例中，可以采用酵 母细胞或哺乳动物细胞偏好的密码子，并采用计算机DNA软件对DNA二聚体基因进行检测， 以排除不利于转录及翻译的序列。在一个优选例中，所述被排除的基因可为内含子切割位 点，转录终止序列等。
[0100] 在获得了本发明新融合蛋白的DNA编码序列之后，首先将其连入合适的表达载 体，再转入合适的宿主细胞。最后，培养、纯化转化的宿主细胞，得到本发明的新的融合蛋 白。SEQIDN0:2和SEQIDN0:6的DNA序列分别显示在SEQIDN0:9和10中。
[0101] 如本文以及权利要求中所用，"载体"指质粒、粘粒、表达载体、克隆载体、病毒载体 等。
[0102] 在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体。比如，选用市售的载 体，然后将编码本发明新融合蛋白的核苷酸序列可操作地连接于表达调控序列，从而形成 蛋白-表达载体。
[0103] 如本文和权利要求所用，"可操作地连接于"指这样一种状况，即线性DNA序列的某 些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果使用信号DNA作为前体表 达并参与多肽的分泌，那么信号DNA(分泌前导序列）就是"可操作地连接于"所述的多肽。 如果一个启动子控制序列的转录，那么它是"可操作地连接于"所述的编码序列。如果核糖 体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么所述的核糖体结合位点是"可操作地连接于" 编码序列。一般，"可操作地连接于"意味着重要残基相邻近；而对于分泌前导序列，则"可 操作地连接于"意味着在阅读框中相邻。
[0104] 如本文和权利要求所用，"宿主细胞"是指原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主 细胞包括大肠杆菌（E.coli)、枯草杆菌（B.subtilis)等。常用的真核宿主细胞包括酵母细 胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞等。在一个优选例中，使用的宿主细胞是真核细胞；在另一优选 例中，使用的宿主细胞是哺乳动物细胞。
[0105] 在获得转化的宿主细胞后，可在适合表达本发明融合蛋白的条件下培养该细胞， 从而表达出融合蛋白。然后再分离出表达的融合蛋白。
[0106] 如本文和权利要求所用，"神经系统疾病或神经性疾病"是指中风、脊柱损伤、和伴 有血脑屏障损伤的神经系统疾病。
[0107] 药物组合物和施用方法
[0108] 由于本发明G-CSF二聚体具有优异的血清半衰期，因此G-CSF二聚体以及含有 G-CSF二聚体为主要活性成分的药物组合物可用于治疗神经损伤相关的疾病，并保护神经 元。在一个优选例中，所述的神经损伤相关的疾病选自下组：中风、脊柱损伤、和伴有血脑屏 障损伤的神经系统疾病。
[0109] 本发明的药物组合物包含安全和有效量的所述G-CSF二聚体及药理上可以接受 的赋形剂或载体。"安全和有效量"是指：化合物的量足以明显改善所需要的病人的病情，而 不至于产生严重的副作用。通常，药物组合物含有0. 〇〇l-l〇〇〇mg的G-CSF二聚体/剂；在 一个优选例中，药物组合物含有〇. 〇5_300mg的G-CSF二聚体/剂；在另一优选例中，药物组 合物含有〇? 5-200mg的G-CSF二聚体/剂。
[0110] 本发明的化合物及其药学上可接受的盐可制成不同的制剂，包含安全和有效量的 所述G-CSF二聚体或其药学上可接受的盐以及药学上可以接受的赋形剂或载体。"安全和有 效量"是指：化合物的量足以显著改善所需要的病人的病情，而不至于产生严重的副作用。 化合物的安全和有效量根据治疗病人的年龄、病情、疗程等具体情况来确定。
[0111] "药学上可以接受的赋形剂或载体"是指：一种或多种不同种类的相容性固体或液 体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。"相容性" 是指：组合物中各组份能与本发明的化合物以及它们之间相互掺和，而不明显降低化合物 的药效。一些药学上可以接受的赋形剂或载体例子有：纤维素及其衍生物（如羧甲基纤维 素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等）、明胶、滑石、固体润滑剂（如硬脂酸、硬脂酸镁）、硫 酸钙、植物油（如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等）、多元醇（如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨 醇等）、乳化剂（如吐温?)、润湿剂（如十二烷基硫酸钠）、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化 剂、防腐剂、无热原水等。
[0112] 施用本发明G-CSF二聚体包括：口服给药、直肠施用、肠胃外（静脉内、肌肉内、或 皮下）给药、以及局部给药。
[0113] 用于口服给药的固体剂型包括：胶囊剂、片剂、丸剂、散剂、和颗粒剂。在这些固体 剂型中，活性化合物与至少一种常规惰性赋形剂（或载体）混合，如柠檬酸钠、磷酸二钙，或 与下述成分的任一种混合：(a)填料或增容剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇、和 硅酸；(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖、和阿拉伯 胶；（c)保湿剂，例如，甘油；⑷崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、 复合硅酸盐、和碳酸钠；（e)缓冲剂，例如，石蜡；（f)吸收加速剂，例如，季胺化合物；（g)润 湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，例如，高岭土；和⑴润滑剂，例如，滑石、 硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂也 可包含缓冲剂。
[0114] 固体剂型如片剂、糖丸、胶囊剂、丸剂、和颗粒剂可采用包衣和壳材制备，如肠衣和 其它本领域公知的材料。这些材料包含不透明剂，并且，这种组合物中活性化合物或化合物 的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。可采用的包埋组分如：聚合物质和 蜡类物质。如果需要，活性化合物也可与以上描述的赋形剂中的一种或多种形成微胶囊形 式。
[0115] 用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆、或酊剂。 除了活性化合物外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂、增 溶剂和乳化剂，例知，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1，3-丁二醇、二甲基甲酰 胺、和油，特别是棉籽油、花生油、蓖麻油、橄榄油、玉米胚油、芝麻油、或其混合物。
[0116] 除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含添加剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜 味剂、矫味剂、和香料。
[0117] 除了活性化合物外，悬浮液还可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙 烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝、琼脂、或其混合物。
[0118] 用于肠胃外给药的组合物也可包含生理学上可接受的无菌含水或无水溶液、分散 液、悬浮液、或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含 水或无水载体、稀释剂、溶剂、或赋形剂包括水、乙醇、多元醇、及其适宜的混合物。
[0119] 用于局部给药的本发明G-CSF二聚体的剂型包括软膏剂、散剂、贴剂、喷射剂、和 吸入剂。活性成分在无菌条件下与生理学上可接受的载体及任何防腐剂、缓冲剂，或必要时 可能需要的推进剂一起混合。
[0120] 本发明G-CSF二聚体可以单独给药，或者与任何药学上可接受的化合物联合给 药。
[0121] 使用药物组合物时，是将安全和有效量的本发明的G-CSF二聚体施用于需要治疗 的哺乳动物（如人），其中施用时剂量为药学上可接受的有效给药剂量。对于60kg体重的 人而言，每次给药剂量通常为0. 01-300mg;在一个优选例中，给药剂量为0. 5-100mg。在决 定实际剂量时，还应考虑本领域的已知因素，如给药途径、病人健康状况等。
[0122] 本发明的G-CSF二聚体具有许多优点，包括（但不限于）：
[0123] 1.更长的体内生物半衰期。
[0124] 2.在神经细胞中更强的激活STAT3的生物活性。
[0125] 3.在缺血性动物模型中，单次或两次注射，具有显著的临床效果。
[0126] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。尽管所述阐述涉及具体实施例，本领域 技术人员应理解本发明可通过这些实施例的变体实现。因此，这些实施例不用于限制本发 明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实