的另一方面，提供了一种制备G-CSF二聚体的方法，所述方法包括步骤：
[0054] a)用表达载体转化哺乳动物细胞，所述的表达载体包含一段编码G-CSF-Fc复合 物的DNA序列，所述核苷酸序列选自下组：SEQIDN0:9-10;
[0055] b)在适于表达G-CSF-Fc复合物和G-CSF二聚体的条件下，培养所述转化的哺乳动 物细胞；和
[0056] 分离和纯化步骤（b)得到的G-CSF二聚体；
[0057] 其中，所述的G-CSF二聚体包含两个G-CSF-Fc复合物，其中，每个G-CSF-Fc复合 物包含选自SEQIDNO:2-7的氨基酸序列。
[0058] 在本发明的另一方面，提供了一种生产分离的多肽的方法，所述方法包括步骤：
[0059] a)用表达载体转化哺乳动物细胞，所述的表达载体包含一段编码所述多肽的DNA 序列，所述核苷酸序列选自下组：SEQIDN0:9-10 ;
[0060] b)在适于表达所述多肽的条件下，培养转化的哺乳动物细胞；和
[0061] 分离和纯化步骤（b)得到的多肽；
[0062] 其中，所述的多肽包含选自SEQIDNO:2-7的氨基酸序列。
【附图说明】
[0063] 图1显示了本发明的一个实施例中的序列如SEQIDN0:1所示的一个G-CSF二聚 体的结构。图中，表示接头，标记为"G-CSF"椭圆形表示G-CSF单体。
[0064] 在该实施例中，所述的G-CSF二聚体通过接头（氨基酸残基175-190位）将一个 G-CSF单体（氨基酸残基1-174位）连接于另一个G-CSF单体（氨基酸残基191-364位）。
[0065] 图2a和图2b显示了本发明的一个实施例中的G-CSF二聚体的结构。图中，表 示接头，标记为"G-CSF"的椭圆形表示G-CSF单体，标记为"C"的椭圆形表示载体蛋白，并 且所述的G-CSF单体位于载体蛋白的N-末端，标记为"Fc"的椭圆形表示人IgG2的Fc片 段。
[0066] 图3a和图3b显示了本发明的一个实施例中的具有氨基酸G-CSF二聚体的结构。 图中，表示连接，标记为"G-CSF"的椭圆形表示G-CSF单体，标记为"C"的椭圆形表示 载体蛋白，其中，所述的G-CSF单体位于载体蛋白的C-末端。标记为"Fc"的椭圆形表示人 IgG2的Fc片段。
[0067] 图4、6显示了本发明的一个实施例中的G-CSF二聚体在局灶性脑缺血动物模型 (Focalcerebralischemia)中的临床效果。
[0068] 图5显示了本发明的一个实施例中的G-CSF二聚体在体外能够激活STAT3的效 力。
【具体实施方式】
[0069] 经过广泛而深入的研宄，发明人成功创造了一种本发明所述的新G-CSF二聚体。 所述的新G-CSF二聚体能够延长体内半衰期、改善药物的动力学性能、减少给药频率、增强 体内药物活性以及促进神经功能的恢复。与等G-CSF摩尔比例的G-CSF单体相比，所述的 G-CSF二聚体还显示了显著的STAT3激活能力，从而改善了药物的生物活性，提高了神经损 伤的治疗效果。前述特征将在如下实施例中进一步描述。
[0070]G-CSF二聚体
[0071] 本发明第一个实施例为如式（I)所示的G-CSF二聚体，其结构如图1-3所示。载 体蛋白包括人IgGl、IgG2、IgG3、IgG4的Fc片段，和人白蛋白。
[0072] 在一个优选例中，G-CSF可以位于载体蛋白的C-末端或N-末端（如图2-3所示）。
[0073] 如本文以及权利要求所用，术语"接头（linker)"指能将两个单体多肽连接在一起 的分子，从而使产生的化合物保持生物活性或较单体多肽具有提高的生物活性。
[0074] 在一个优选例中，"接头（linker) "指有机接头或由肽键连接的氨基酸序列，或指 由肽键连合或连接的两个氨基酸；或指不是由常态肽键连合的两个氨基酸序列或多肽域。 接头序列由一段多核苷酸读码框编码，所述的多核苷酸通过接头连接，介于编码两个多肽 域的序列之间。
[0075] 在另一个优选例中，"接头"还指位于两个G-CSF单体之间的、起连接作用的短肽。 接头的长度没有特别限制。一段接头的长度通常为5-50个氨基酸残基，通常，一段接头不 影响或不显著影响两个G-CSF单体形成正确的折叠和构象。
[0076] -些接头的例子包括：有机接头、包含3-50个氨基酸的短肽、和前述式（II)所示 的多肽。
[0077] 在一个优选例中，所述的有机接头可为氧甲基苯基乙酰胺基甲基 (oxymethylphenylacetamidomethyl) (PAM)树脂、4_氧甲基-苯基乙酰胺基甲基树脂 (4-oxymethylphenylacetamidomethylresin)、氯甲基化聚苯乙稀树脂（chloromethyl polystyreneresin)、或其组合，并具有足够小的空间位阻，以不影响或不显著影响两个 G-CSF单体形成的正确的折叠和构象。
[0078] 在另一优选例中，所述的接头包含具有相对较小结构的氨基酸，不影响或不显著 影响两个G-CSF单体形成的正确的折叠和构象，例如甘氨酸（glysine)、丙氨酸、脯氨酸等。
[0079] 在另一优选例中，所述的接头包含选自下组的氨基酸序列：
[0080] (a)疏水性氨基酸甘氨酸（Gly)和脯氨酸（Pro)构成的3-15个氨基酸残基的氨基 酸序列，例如Gly-Pro-Gly-Pro-Gly-Pro;
[0081] (b)多克隆位点所编码的氨基酸序列。该序列通常包含5-20个氨基酸残基；在一 个优选例中，该序列包含10-20个氨基酸残基；
[0082] (c)来自于G-CSF单体之外的蛋白的氨基酸序列，例如IgG或白蛋白的氨基酸序 列；
[0083](d)包含上述（a)、（b)和（c)的任意组合的氨基酸序列。
[0084] 在一个优选例中，所述的接头的序列是GSGGGSGGGGSGGGGS(例如SEQIDNO: 1中 第175-190位氨基酸残基）。在另一优选例中，所述的接头具有ASTKGP(例如SEQIDNO:4 中的第175-180位氨基酸残基）的序列。
[0085] 在另一优选例中，可在G-CSF二聚体的N端或C末端添加其他不影响G-CSF单体 生物学活性的氨基酸序列。在一个优选例中，这些添加的氨基酸序列对表达（如信号肽）、 纯化（如6XHis序列、酿酒酵母a -因子信号肽切割位点）有利，或提高G-CSF二聚体的 生物活性。
[0086] 序列表
[0087]SEQIDNO: 1表示如图1所示的G-CSF二聚体，包含通过接头（第175-190位氨 基酸残基），将一个G-CSF单体（第1-174位氨基酸残基）连接于另一个G-CSF单体（第 191-364位氨基酸残基）。
[0088] 5￡〇10勵:2表示构成6-〇5?二聚体的6-〇5?4(：复合物，如图2&和图213所示，其 包含一个G-CSF单体（第1-174位氨基酸残基），一个人IgG2的Fc片段（第191-418位 氨基酸残基），以及连接所述G-CSF单体和所述Fc片段的肽（第175-190位氨基酸残基）。 二个G-CSF-Fc复合物带有Fc片段，通过所述Fc片段的配对构成所述的二聚体。在一个实 施例中，所述的Fc片段通过所述的Fc片段的多个二硫键配对；在另一个实施例中，所述的 二硫键的数量为2或4。
[0089]SEQIDNO: 3表示构成G-CSF二聚体的G-CSF-Fc复合物，如图3a和图3b所示，其 包含一个G-CSF单体（第245-418位氨基酸残基），人IgG2的Fc片段（第1-228位氨基酸 残基），以及连接所述G-CSF单体和所述Fc片段的肽（第229-244位氨基酸残基）。二个 G-CSF-Fc复合物带有Fc片段，通过Fc片段的配对构成二聚体。在一个实施例中，所述Fc 片段通过所述的Fc片段的多个二硫健配对；在另一实施例中，所述的二硫键的数量为2或 4〇
[0090]SEQIDNO:4表示构成G-CSF二聚体的G-CSF-Fc复合物，如图2a和图2b所示， 其包含一G-CSF单体（第1-174位氨基酸残基），人IgG2的Fc片段（第181-403位氨基 酸残基），连接所述G-CSF单体和所述Fc片段的肽（第175-180位氨基酸残基）。与SEQ IDNO: 2相比，SEQIDNO: 4连接所述G-CSF单体和所述Fc片段的肽较短（少于10个氨基 酸）。而且，SEQIDN0:4删除了短序列ERKCC，因此除去了两个二硫键，从而减少了铰链的 错配。二个G-CSF-Fc复合物带有Fc片段，通过Fc片段的配对构成二聚体。在一个实施例 中，所述Fc片段通过所述的Fc片段的多个二硫健配对；在另一个实施例中，所述的二硫键 的数量为2或4。
[0091] SEQIDNO: 5表示构成G-CSF二聚体的G-CSF-Fc复合物，如图3a和图3b所示，其 包含一个G-CSF单体（第230-403位氨基酸残基），人IgG2的Fc片段（第1-223位氨基酸 残基），连接所述G-CSF单体和所述Fc片段的肽（第224-229位氨基酸残基）。与SEQID NO: 3相比，SEQIDNO: 5连接所述G-CSF单体和所述Fc片段的肽较短（少于10个氨基酸 残基）。而且，SEQIDN0:5删除了短序列ERKCC，因此除去了两个二硫键，从而减少了铰链 的错配。二个G-CSF-Fc复合物带有Fc片段，通过Fc片段的配对构成二聚体。在一个实施 例中，所述Fc片段通过所述的Fc片段的多个二硫健配对；在另一个实施例中，所述的二硫 键的数量为2或4。
[0092] SEQIDN0:6表示构成G-CSF二聚体的G-CSF-Fc复合物，如图2a和图2b所示，其 包含一个G-CSF单体（第1-174位氨基酸残基），人IgG2的Fc片段（第191-413位氨基酸 残基