抗副溶血弧菌ompk卵黄抗体制备及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物制品制备技术领域，具体地涉及一种抗副溶血弧菌ompk卵黄抗 体的制备及其快速检测应用，可用于副溶血弧菌引起的水生动物疾病的检测。
【背景技术】
[0002] 近年来，随着海水养殖规模的不断扩大，病害频繁发生，成为制约养殖业健康发展 的主要瓶颈之一，其中尤以弧菌病最为严重。业已证实，副溶血弧菌等是海水养殖动物的主 要病原弧菌，同时也关系到水产品质量安全。然而，国内还缺乏成熟的弧菌快速检测手段以 满足对水产疾病控制和水产品安全，特别是早期诊断技术和手段。目前，国内外已经开展了 大量弧菌病免疫检测技术的研宄，但是大多是采用全菌苗制备多克隆抗体或多克隆抗体而 建立的快速检测方法，目前，国内外已经开展了大量弧菌病免疫检测技术的研宄，但是大多 是采用多克隆抗体而建立的快速检测方法，存在交叉反应、特异性和灵敏性等方面的缺陷， 而卵黄抗体具有不同于哺乳动物抗体的特殊生物学特性，尤其是由亚单位疫苗制备的卵黄 抗体具有更好的特异性和灵敏性，在水产动物致病弧菌的快速检测中具有广阔的应用前 景。
【发明内容】
[0003] 本发明要解决的技术问题在于提供一种抗副溶血弧菌ompk的卵黄抗体制备方 法，并作为诊断抗体建立检测副溶血弧菌的ELISA方法，用于副溶血弧菌的检测与防治。
[0004] 本发明是通过如下技术方案来实现的
[0005] -种抗副溶血弧菌ompk的卵黄抗体制备方法，利用副溶血弧菌重组ompk蛋白对 蛋鸡进行接种免疫，对接种后的鸡所产的鸡蛋在除去蛋白后用蒸馏水漂洗得到纯卵黄液， 对纯卵黄液进行离心、收集上清液，应用饱和硫酸铵溶液沉淀法制备粗制的卵黄抗体，再应 用凝胶层析柱进一步纯化，获得精制抗副溶血弧菌ompk的卵黄抗体。
[0006] 进一步，所述的副溶血弧菌重组ompk蛋白的制备方法，根据ompk基因序列设计引 物，利用所述引物对抗副溶血弧菌的基因组DNA进行PCR扩增，用琼脂糖凝胶分离并回收 ompk片段，并用试剂盒纯化回收的ompk片段，将纯化后的ompk片段、原核表达载体pET28a 进行双酶切，用T4连接酶连接ompk酶切回收产物和pET28a酶切回收产物，得到重组阳性 质粒，将重组阳性质粒在BL21感受态细胞中诱导表达，表达产物利用柱层析进行纯化。
[0007] 进一步，所述根据ompk基因序列设计引物：
[0008]上游引物vpl-〇mpk-28a-F:5' -CCGGAATTCTTCGGCGGTCGCTCTGG-3'
[0009] 下游引物vpl-〇mpk-28a-R:5' -CGCGTCGACGAACTTGTAAGTTACTGC-3'(划线部分为 Sail酶切位点）。
[0010] 本发明还提供一种抗副溶血弧菌ompk的卵黄抗体间接ELISA方法，所述方法的 最佳反应条件：抗原最适工作浓度浓度为1X108cfu/mL，包被4°C过夜；一抗IgY稀释度为 l:28;IgY-HRP酶标抗体作1:20000稀释；选择底物的最佳反应时间为20min。
[0011] 本发明与现有技术相比的有益效果：
[0012] 本发明用高纯度副溶血弧菌外膜蛋白ompk，与等体积的弗氏完全佐剂，充分乳化， 免疫健康海兰蛋鸡，每隔10天加强免疫1次，第3次加强免疫后1周开始收集鸡蛋。鸡蛋 在除去蛋白后用蒸馏水漂洗得到纯卵黄液，应用饱和硫酸铵溶液沉淀法制备粗体的卵黄抗 体，再应用SephadexG-200凝胶层析柱进一步纯化，所得样品经SDS-PAGE电泳检测，证实 获得精制抗副溶血弧菌外膜蛋白ompk的卵黄抗体。本发明以精制抗副溶血弧菌外膜蛋白 0MPK的卵黄抗体作为检测副溶血弧菌的快速检测方法，具有较高的专一性和特异性。
[0013] 建立基于IgY的间接ELISA测定抗原浓度的技术方法，确定抗原包被浓度、一抗 IgY和酶标二抗最适稀释倍数，抗原包被条件的选择，底物的最佳反应时间等间接ELISA的 实验条件。用建立起来的间接ELISA检测几种常见的致病性海洋弧菌及常见细菌：副溶血 弧菌、哈氏弧菌、鳗弧菌、创伤弧菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。发现只能检测到副溶血弧 菌，其他细菌皆为阴性，表现出了较高的特异性。
【附图说明】
[0014] 图1重组0MPK的表达、纯化及Westernblotting检测M:Marker1:阴性对照2: 诱导前3:诱导后4:纯化的ompk，5:纯化的ompk蛋白Westernblotting检测。
[0015] 图2硫酸铵沉淀纯化后IgYSDS-PAGE电泳图：M蛋白Mark ;1卵黄WSF ;2硫酸铵法 粗提卵黄抗体；
[0016] 图3IgY的凝胶洗脱图谱；
[0017] 图4不同纯化阶段IgY凝胶电泳图：M Mark ;1 WSF ;2第一次硫酸铵后；3第二次 硫酸铵后；4凝胶层析后。
【具体实施方式】
[0018] 下面通过实施例来对本发明的技术方案作进一步的解释，但本发明的保护范围不 受实施例任何形式上的限制。
[0019] -种抗副溶血弧菌OMPK的卵黄抗体制备方法，利用副溶血弧菌重组ompk蛋白对 蛋鸡进行接种免疫，对接种后的鸡所产的鸡蛋在除去蛋白后用蒸馏水漂洗得到纯卵黄液， 对纯卵黄液进行离心、收集上清液，应用饱和硫酸铵溶液沉淀法制备粗制的卵黄抗体，再应 用SephadexG-200凝胶层析柱进一步纯化，获得精制抗副溶血弧菌ompk的卵黄抗体。具 体方法如下：
[0020] 1、副溶血弧菌重组ompk蛋白的制备
[0021] (l)PCR引物设计
[0022] 根据ompk基因组序列，利用Primer(Version5. 0)基因分析软件，设计引物，进行 PCR扩增，引物序列如下：
[0023]上游引物vpl-〇mpk-28a-F:5' -CCGGAATTCTTCGGCGGTCGCTCTGG-3' (划线部分为 EcoRI酶切位点）
[0024]下游引物vpl-〇mpk-28a-R:5' -CGCGTCGACGAACTTGTAAGTTACTGC-3'(划线部分为 Sail酶切位点）
[0025] (2)PCR扩增、电泳
[0026]以引物vpl-〇mpk-28a-F/vpl-〇mpk-28a-R进行PCR扩增。PCR扩增反应体系为：
【主权项】
1. 一种抗副溶血弧菌ompk的卵黄抗体制备方法，其特征在于利用副溶血弧菌重组 ompk蛋白对蛋鸡进行接种免疫，对接种后的鸡所产的鸡蛋在除去蛋白后用蒸馏水漂洗得到 纯卵黄液，对纯卵黄液进行离心、收集上清液，应用饱和硫酸铵溶液沉淀法制备粗制的卵黄 抗体，再应用凝胶层析柱进一步纯化，获得精制抗副溶血弧菌ompk的卵黄抗体。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的副溶血弧菌重组ompk蛋白的制备 方法，根据ompk基因序列设计引物，利用所述引物对抗副溶血弧菌的基因组DNA进行PCR 扩增，用琼脂糖凝胶分离并回收ompk片段，并用试剂盒纯化回收的ompk片段，将纯化后 的ompk片段、原核表达载体pET28a进行双酶切，用T4连接酶连接ompk酶切回收产物和 pET28a酶切回收产物，得到重组阳性质粒，将重组阳性质粒在BL21感受态细胞中诱导表 达，表达产物利用柱层析进行纯化。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述根据ompk基因序列设计引物：上游引 物vpl-〇mpk-28a-F:5' -CCGGAATTCTTCGGCGGTCGCTCTGG-3' 下游引物vpl-〇mpk-28a-R:5' -CGCGTCGACGAACTTGTAAGTTACTGC-3'。
4. 一种抗副溶血弧菌ompk的卵黄抗体间接ELISA方法，其特征在于所述方法的反应条 件：抗原工作浓度浓度为1X108cfu/mL，包被4°C过夜；一抗IgY稀释度为1:28;IgY-HRP酶 标抗体作1:20000稀释；选择底物的反应时间为20min。
【专利摘要】一种抗副溶血弧菌ompk的卵黄抗体制备方法，属于生物制品制备技术领域，它的步骤为利用副溶血弧菌重组ompk蛋白对蛋鸡进行接种免疫，对接种后的鸡所产的鸡蛋在除去蛋白后用蒸馏水漂洗得到纯卵黄液，对纯卵黄液进行离心、收集上清液，应用饱和硫酸铵溶液沉淀法制备粗制的卵黄抗体，应用饱和硫酸铵溶液沉淀法制备粗制的卵黄抗体，再应用凝胶层析柱进一步纯化，获得精制抗副溶血弧菌ompk的卵黄抗体。本发明以精制抗副溶血弧菌OMPK的卵黄抗体作为检测副溶血弧菌的快速检测方法，具有较高的专一性和特异性。
【IPC分类】C12N15-31, C12N15-70, C07K16-12, C07K16-02, G01N33-569
【公开号】CN104710530
【申请号】CN201510118068
【发明人】闫茂仓, 王雪鹏, 胡伟丽, 张赛乐, 郝金婷
【申请人】浙江省海洋水产养殖研究所, 山东农业大学
【公开日】2015年6月17日
【申请日】2015年3月17日