一种生物制品的内毒素去除方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及一种生物制品的内毒素去除方法。
【背景技术】
[0002] 内毒素是脂多糖（LPS)，来自革兰阴性菌的外膜，其结构包含3个区域，即类脂A 区、核心多糖区和特异性多糖区，是热原的一种。极微量的内毒素进入动物或人体内都会引 发强烈的炎症反应，导致轻微如发热，重则死亡的严重后果。
[0003] 而生物制品中，内毒素的污染广泛存在，比如，单克隆抗体作为生物大分子药物， 生产和纯化工艺复杂，有诸多环节可能将内毒素带入，因此需要去除内毒素，保证生物制品 的安全性。各国药监部门对生物产品中的内毒素含量也均有严格规定。欧洲药典规定注射 剂内毒素限度不得高于5EUAkg?h)，EU为内毒素单位，每EU内毒素约相当于100pg。随 着生物制品的大量使用，对生物制品中内毒素残留限的要求越高，但是因为内毒素分子结 构复杂且不均一，导致内毒素可以多种方式与溶液中的蛋白质相互作用，形成复合物，大大 增加了去除的难度。并且，在去除内毒素同时，还要尽可能减小活性成分的损失。
[0004] 目前，常用的去除内毒素的方法有活性炭吸附、萃取、超滤、离子交换色谱等，但是 去除效果均不佳。如，李彦英等。单克隆抗体纯化过程中内毒素去除方法分析，生物技术通 讯，2013年1月24(1)中，采用离子交换色谱的方式处理单克隆抗体溶液，内毒素含量降低 至5EU/ml后，便很难进一步降低；采用对内毒素有亲和作用的氨基酸作为层析介质时，最 低也仅能降低至0. 2~0. 3EU/mg;公开号为103923211的专利申请中，制备人血浆来源人 血清白蛋白单克隆抗体（PHSA)时，先采用rHSA填料亲和层析特异性吸附pHSA后，再采用 离子交换的方式去除内毒素，得到的pHSA制品中内毒素含量仍然高达0.lEU/mg。
[0005] 因此，采用吸附方法去除内毒素，不仅去除效果不佳，成本也很高，亟需改进。
【发明内容】
[0006] 为了解决上述问题，本发明提供了一种新的内毒素去除方法以及该方法制备得到 的生物制品。
[0007] 本发明生物制品的内毒素去除方法，包括如下步骤：
[0008] (1)取待处理生物制品，阴离子交换层析；
[0009] (2)羟基磷灰石层析，即可。
[0010] 步骤⑴中，所述阴离子交换层析的步骤如下：
[0011] a、用平衡液平衡阴离子交换层析柱；
[0012]b、取待处理样品，调节pH以及电导率与平衡液一致；
[0013] c、上样，收集280nm紫外吸收峰处的流出液；
[0014] d、用平衡液冲洗，收集280nm紫外吸收峰处的流出液；
[0015] e、合并步骤c和步骤d的流出液，即可。
[0016] 步骤a中，所述阴离子交换层析柱的填料为Q Sepharose High Performance填料、 QSepharoseFastFlow填料、DEAESepharoseFastFlow填料或者NuviaQ填料。
[0017] 步骤a和步骤d中，所述平衡液是含有NaCl的磷酸缓冲液，其pH为6. 1~7. 9,电 导率为 8. 3 ~24.lS/cmmS/cm，NaCl浓度为 50 ~150mmol/L，憐酸盐浓度 5 ~50mmol/L。
[0018] 步骤（2)中，所述羟基磷灰石层析的步骤如下：
[0019] ①用平衡液平衡羟基磷灰石层析柱；
[0020] ②取待处理样品，调节pH以及电导率与平衡液一致；
[0021] ③上样，用平衡液冲洗至流出液280nm紫外吸收回到基线；
[0022] ④用洗脱液洗脱，收集280nm紫外吸收峰处的流出液，即可。
[0023] 步骤①中，所述羟基磷灰石层析柱使用的填料是CHTCeramicHydroxyapatite TypeI填料或者CHTCeramichydroxyapatitetypeII填料。
[0024] 步骤①和③中，所述平衡液是含有NaCl的磷酸缓冲液，其pH为6. 5~8. 0,电导率 为 8. 4 ~17. 8mS/cm，NaCl浓度为 50 ~120mmol/L，憐酸盐浓度为 10 ~40mmol/L。
[0025] 步骤④中，所述洗脱液是含有NaCl的磷酸缓冲液，其pH6. 5~7. 9,NaCl浓度为 200~500mmol/L，憐酸盐浓度为5~40mmol/L。
[0026] 本发明还提供了前述任意一项方法制备得到的生物制品。优选地，所述生物制品 的内毒素含量低于〇. 〇5EU/mg。优选地，所述生物制品是单克隆抗体。
[0027] 本发明方法可以有效去除内毒素，蛋白回收率高，不需要采用特定抗体吸附目 标蛋白，处理方法简单，成本低廉，采用本发明方法处理后的生物制品的内毒素含量小于 0. 05EU/mg蛋白，安全性好，临床应用前景良好。
[0028] 显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离 本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0029] 以下通过实施例形式的【具体实施方式】，对本发明的上述内容再作进一步的详细说 明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容 所实现的技术均属于本发明的范围。
【具体实施方式】
[0030] 实施例1本发明内毒素去除方法
[0031] 1、试验材料
[0032] 抗体蛋白样品的获得：
[0033] 步骤1、一种可表达抗⑶20单克隆抗体的CH0细胞的制备：
[0034] 制备表达抗⑶20单克隆抗体的CH0细胞：采用PCR技术和DNA重组技术将 pSV2-dhfr载体（ATCC产品）中的dhfr(二氢叶酸还原酶）表达单元克隆到pCDNA3. 1 (+) 载体（Invitrogen公司产品）中，构建可表达DHFR的哺乳动物细胞表达载体pBR)l。
[0035] 根据文献报道（USPatent,US6399061)，采用化学合成技术合成重组抗CD20单克 隆抗体的轻链和重链基因片段；采用DNA重组技术将合成的基因片段分别克隆到pBFOl载 体中，分别构建可表达抗⑶20单克隆抗体的轻链和重链多肽的重组表达载体pBR)l-⑶20L 和PBF01-CD20H。
[0036] 采用脂质体转染法，将构建的重组表达载体pBR)l-CD20L和pBR)l-CD20H共转染 Invitrogen公司的CH0-DG44细胞，然后经G418抗性筛选阳性克隆，然后再通过ELISA法筛 选高表达抗体的克隆，然后再用MTX(甲氨蝶呤）逐步加压、筛选、克隆，最终获得一株高表 达抗CD20单克隆抗体的CHO细胞株CH0-CD20。
[0037] 步骤2、细胞培养
[0038] 采用批次流加培养，得到细胞培养液。
[0039] 步骤3、细胞培养上清的分离
[0040] 采用深层过滤的方法获得细胞培养上清：采用Millipore公司的D0HC和B1HC深 层滤器按顺序过滤步骤2中的细胞培养液，收集滤过液。
[0041] 步骤4、ProteinA亲和层析
[0042] 层析填料：采用GE公司的MabselectSuRe层析填料（一种耐碱的ProteinA填 料）。
[0043]层析流速：5〇~3〇Ocm/h。
[0044] 填料清洗：用