专利名称：一种细菌内毒素检测方法
技术领域：
本发明属于药物领域，特别涉及一种细菌内毒素检测方法。
背景技术：
细菌内毒素是G-菌细胞壁上的特有结构，其主要成分是脂多糖，具很强的热原活性。当细菌内毒素通过消化道进入人体时并不产生危害，但内毒素通过注射等方式进入血液时，则可导致不同程度的内毒素血症。因此，对于注射剂及其生产中所用的原辅料都应进行细菌内毒素的控制，以确保产品质量，保障用药安全。细菌内毒素的检测常用方法是家兔热原法和鲎试剂法，目前运用较多的是鲎试剂法。采用该方法进行细菌内毒素检测之前，须进行干扰实验，排除供试品对鲎试剂实验的干扰，确保该方法的准确度。对于非水溶性供试品，由于其与细菌内毒素检测用水不能互溶，混合后一段时间出现分层，导致难以有效检测。目前多采用的方法是在分层以前取供试品与细菌内毒素检测用水的混合物，或者通过离心取水相部分进行干扰实验，但是取供试品与细菌内毒素检测用水的混合物进行干扰实验需要稀释更大的倍数才能排除干扰甚至不能排除干扰；离心方法存在操作复杂、容易造成二次污染，出现假阳性，同时不能确保油相中的细菌内毒素完全溶解在水相中，在进行细菌内毒素检测时，容易出现假阴性等缺点。对于含有这类非水溶性原料的药品，虽然能够与水互溶，在采用细菌内毒素检测用水稀释时，仍然存在细菌内毒素在供试品中分散不均匀导致干扰不能成立的情况。商君等，“油剂普鲁卡因青霉素注射液细菌内毒素检查方法的研究”，中国兽药杂志2000,34 (1):20 22，采用在样品中加入适量无菌、内毒素合格的0.lmol/L氢氧化钠、1%吐温-80溶液，并用0.lmo l/L盐酸调节样品液的pH值，解决了油剂普鲁卡因青霉素注射液的溶解问题，但是该方法操作复杂，并且经研究，不能广泛应用于常用的非水溶性药品。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种新的细菌内毒素检测方法。本发明细菌内毒素检测方法，它包括如下步骤:(I)配制细菌内毒素检测用分散液:取甘油、阴离子表面活性剂和非离子表面活性齐U，溶于注射用水或细菌内毒素检查用水中，去内毒素，得分散液，其中，甘油浓度为0.1 2% (v/v),阴离子表面活性剂浓度为0.05 0.5% (w/v)，非离子表面活性剂浓度为0.1 1% (v/v);(2)检测:以步骤(I)制备的分散液取代细菌内毒素检查用水，按照细菌内毒素检查法检测待检样品。细菌内毒素检查用水:系指内毒素含量小于0.015EU/ml(用于凝胶法)或0.005EU/ml (用于光度测定法)且对内毒素试验无干扰作用的灭菌注射用水(详见《中华人民共和国药典(2010版)第二部》附录XI E细菌内毒素检查法)；
细菌内毒素检查法，指《中华人民共和国药典(2010版)第二部》附录XI E规定的细菌内毒素检查法。其中，步骤(I)中，所述阴离子表面活性剂HLB值为I 20。优选地，所述阴离子表面活性剂的HLB值为12 20。其中，步骤(I)中，所述阴离子表面活性剂包括油酸、油酸钠或者油酸三乙醇胺中的一种或者多种。其中，步骤(I)中，所述非离子表面活性剂的HLB值为I 20。优选地，所述非离子表面活性剂的HLB值为13.3 16.7。步骤(I)中，所述非离子表面活性剂包括聚山梨酯类系列中的一种或者多种。步骤(I)中，所述甘油浓度为1% (v/v)，阴离子表面活性剂浓度为0.1% (w/v)，非离子表面活性剂浓度为1% (v/v)。步骤(I)中，去内毒素采用的方法是:用孔径为IOOnm微孔滤膜将溶液过滤。本发明细菌内毒素检测方法 ，可以有效排除非水溶性供试品对鲎试剂实验的干扰，准确度高，检测步骤简单。以下通过实施例形式的具体实施方式
，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
图1内毒素检测报告，其中，管号1-8:标准曲线；9_10:离心法制备供试品溶液；11-12:阳性对照；13-14:实施例1分散液作为溶剂制备的供试品溶液I ;15-16:实施例1分散液对照样品的制备I ;17_18:实施例2分散液作为溶剂制备的供试品溶液2 ； 19-20:实施例2分散液对照样品2 ；21-22:实施例3分散液作为溶剂制备的供试品溶液3 ；23~24:实施例3分散液对照样品3 ；25-26:实施例4分散液作为溶剂制备的供试品溶液4 ；27~28:实施例4分散液对照样品4 ；29-30:实施例5分散液作为溶剂制备的供试品溶液5 ;31_32:实施例5分散液对照样品5。
具体实施例方式实施例1本发明检测方法及有效性验证一、检测方法1、分散液配制(I)试剂选择阴离子表面活性剂选择油酸钠，其HBL值为18 ;非离子表面活性剂选择聚山梨酯-80，其HBL值为15。(2)实验器具及试剂热原的去除所有用的实验器具，包括碘量瓶、容量瓶、药匙、烧杯在250°C下干烤2h，去除其中的热原；油酸钠放置于除去热原的碘量瓶中，在150°C下干烤2h。(3)分散液的配制称取已经在150°C干烤2h的油酸钠0.lg，用细菌内毒素检测用水配制的1%甘油溶液在已经去除热原的烧杯中溶解，配制成浓度为0.1%的油酸钠溶液，然后加入1%聚山梨酯-80，使得整个体系各原料的配比为:油酸钠0.1% (w/v)，甘油1% (v/v)、聚山梨酯-801%(v/v),最后用细菌内毒素检测用水配制的0.lmol/L HCl溶液调节pH在6_8左右。(4)分散液溶液的内毒素去除将得到的溶液用孔径为IOOnm微孔滤膜将溶液过滤到已除热原的碘量瓶中。2、以步骤I制得的分散液取代细菌内毒素检查用水，按照细菌内毒素检查法检测待检样品，即可。
二、分散液溶液细菌内毒素含量验证实验按照细菌内毒素检测用水的要求将该分散液溶液的细菌内毒素限值定为0.015EU/ml。采用两个不同生产厂家的鲎试剂对该溶液进行细菌内毒素干扰实验，建立该分散液细菌内毒素验证方法为采用灵敏度为0.015EU/ml的鲎试剂对该溶液进行细菌内毒素检测。a、细菌内毒素限值的确定按照细菌内毒素检测用水的要求将该分散液溶液的细菌内毒素限值定为0.015EU/ml。b、供试品的干扰试验鲎试剂灵敏度复核试验按《中国药典》2010年版二部附录XI E “细菌内毒素检查法”，对所用两个厂家鲎试剂的灵敏度进行复核。根据鲎试剂灵敏度的标示值(X )，将细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器上混匀15分钟，然后制成2入、A ,0.5A ,0.25 A四个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均在旋涡混合器上混匀30秒钟。按检查法项下试验，每一浓度平行做4支，同时，用细菌内毒素检查用水做2支阴性对照管，如最大浓度2.0 A管均为阳性，最低浓度0.25 A管均为阴性，阴性对照管均为阴性，按下式计算反应终点浓度的几何均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值(、C)。A c=lg_1( E X/4)式中X为反应终点浓度的对数值(lg)。反应终点浓度是系列浓度递减的内毒素溶液中最后一个呈阳性结果的浓度。复核结果见表I。表I鲎试剂灵敏度复核结果
权利要求
1.一种细菌内毒素检测方法，其特征在于:它包括如下步骤: (1)配制细菌内毒素检测用分散液:取甘油、阴离子表面活性剂和非离子表面活性剂，溶于注射用水或细菌内毒素检查用水中，调pH至6 8，去内毒素，得分散液，其中，甘油浓度为0.1 2% (v/v),阴离子表面活性剂浓度为0.05 0.5% (w/v)，非离子表面活性剂浓度为 0.1 1% (v/v)； (2)检测:以步骤(I)制备的分散液取代细菌内毒素检查用水，按照细菌内毒素检查法检测待检样品。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于:步骤(I)中，所述阴离子表面活性剂HLB值为I 20。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于:所述阴离子表面活性剂的HLB值为12 20。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于:步骤(I)中，所述阴离子表面活性剂包括油酸、油酸钠 或者油酸三乙醇胺中的一种或者多种。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于:步骤(I)中，所述非离子表面活性剂的HLB值为I 20。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于:所述非离子表面活性剂的HLB值为13.3 16.7。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于:步骤(I)中，所述非离子表面活性剂包括聚山梨酯类系列中的一种或者多种。
8.根据权利要求1的检测方法，其特征在于:步骤(I)中，所述甘油浓度为1%(v/v),阴离子表面活性剂浓度为0.1% (w/v)，非离子表面活性剂浓度为1% (v/v)。
9.根据权利要求1的检测方法，其特征在于:步骤(I)中，去内毒素采用的方法是:用孔径为IOOnm微孔滤膜将溶液过滤。
全文摘要
本发明公开了一种细菌内毒素检测方法，它包括如下步骤(1)配制细菌内毒素检测用分散液取甘油、阴离子表面活性剂和非离子表面活性剂，溶于注射用水或细菌内毒素检查用水中，去内毒素，得分散液，其中，甘油浓度为0.1～2%(v/v)，阴离子表面活性剂浓度为0.05～0.5%(w/v)，非离子表面活性剂浓度为0.1～1%(v/v)；(2)检测以步骤(1)制备的分散液取代细菌内毒素检查用水，按照细菌内毒素检查法检测待检样品。本发明细菌内毒素检测方法准确度高，操作简单。
文档编号G01N33/579GK103245785SQ201310116759
公开日2013年8月14日 申请日期2013年4月7日 优先权日2013年4月7日
发明者朱雪梅, 杨秋艳, 杨军, 王利春, 王晶翼, 梁隆, 沈鑫, 程志鹏 申请人:四川科伦药业股份有限公司