专利名称：血液细菌内毒素检测试剂盒的制备和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及细菌内毒素检测技术领域，尤其是涉及一种用于体液细菌内毒素检测的特异性鲎试剂和血液细菌内毒素检测试剂盒。
背景技术：
鲎试剂，是一种是由海洋生物鲎的血液变形细胞溶解物制成的生物检测试剂，由于生物活性高、使用方便、安全，因此其主要用作注射药品、生物制品、放射性药品、血液透析液、透析用水、血液保养液和医疗器具(输、注器具)的细菌内毒素检测，为确保药品质量和用药安全发挥了积极作用。细菌内毒素，是革兰氏阴性菌细胞壁上的一种脂质A成分和微量蛋白的复合物，细菌内毒素分子是一种双糖结构的酰胺类脂复合物，其分子量一般在2000-2300之间。因 分子量小，极易从肠系膜或组织液侵入，随血液进入循环系统。内毒素进入机体后作用于体温调节中枢引起发热而影响机体生理病理反应等。细菌内毒素不等同于活细菌，它是细菌死亡或解体后才释放出来的一种具有内毒素生物活性的致热原质。在二十世纪90年代以来，在医院临床也有学者用鲎试剂检测人体血液细菌内毒素的研究，试图将细菌内毒素检查法应用到人体液的检查，以辅助疾病诊断。但是，由于人或动物血液成分对鲎试剂(TAL或LAL)与细菌内毒素反应具有强干扰性，如，纤维蛋白原、抗凝血酶、纤维蛋白酶抑制剂、胆红素等成分，可对鲎试剂的凝胶反应产生增强或抑制作用。同时，(1，3)- β -D-葡聚糖可激活普通鲎试剂中的G因子而发生旁路反应，引起凝集反应而造成细菌内毒素检测出现假阳性结果。因此，一直以来因普通鲎试剂对体液细菌内毒素和葡聚糖成分的分辨率差，使得细菌内毒素与鲎试剂的专属性反应无法鉴别。而且，由于缺乏一种可行的体液细菌内毒素与葡聚糖的快速分离提取方法，使该技术成为当今世界医学卫生领域的一道难题。
发明内容
本发明为了弥补现有普通鲎试剂的不足，提供一种特异性鲎试剂及其制备方法，和含有该特异性鲎试剂的血液细菌内毒素检测试剂盒，及将它们应用于血液样本中的细菌内毒素检测的检测方法。本发明提供的特异性鲎试剂及检测试剂盒，可以定性鉴别鲎试剂与细菌内毒素和葡聚糖类物质的凝胶反应，从而提高血液细菌内毒素检测结果的可靠性，实现对血液细菌内毒素的定量检测；采用它们进行血液细菌内毒素的检测具有灵敏度高、检测结果可靠和检测效率高的特点。本发明提供的特异性鲎试剂的制备方法，包括以下步骤—种特异性鲎试剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤Α.采血，加入与鲎血的体积比为1:6 1:10的抗凝剂；B.分离细胞将鲎血移至离心瓶内，在750-850转/分的速度下离心分离，弃血清；
C.裂解细胞将步骤B余下的鲎血细胞移至收集瓶内，按鲎血细胞体积的40%-50%的量加入细胞裂解液，裂解细胞得鲎血细胞溶解物；D.分离细胞壁按照与鲎血细胞溶解物的体积比为1:0. 8 1:1. 2的量向鲎血细胞溶解物中加入氯仿，并加入适量聚乙二醇8000，随即混合形成混合溶液，然后离心，分离提取物，制得鲎试剂原液。E.加入促活剂及G因子抑制剂，配制半成品按鲎试剂原液体积与促活剂体积比为1:0. 15 1:0. 30的比例加入预先调配好的促活剂，按照鲎试剂原液体积与G因子抑制剂体积比为1:0. 25 1:0. 50的比例加入G因子抑制剂，搅匀，制成鲎试剂半成品。F.灌装、冷冻干燥和封口，制得特异性鲎试剂成品。所述的特异性鲎试剂的制备方法，其步骤A中的抗凝剂是这样配制的向适量纯化水中加入预配好的辅料溶液，使每IOOml溶液中含咖啡因或茶碱O. 015M O. 04M，含 NaClO. 15M O. 35M。所述的特异性鲎试剂的制备方法，其步骤C中的细胞裂解液是这样配制的向纯化水中加入O. 05M/ml的Tris-HCl溶液，调PH值为6. O 8. O。所述的特异性鲎试剂的制备方法，其步骤D中的聚乙二醇8000在所述混合溶液中的浓度为I. 5 3mg/ml。所述的特异性鲎试剂的制备方法，其步骤E中的促活剂是这样配制的在适量纯化水中加入KCUMgSO4或CaCl2溶液，使每毫升促活剂含KCl O. 15 O. 30M，含MgSO4O. 15 O. 30M 或含 CaCl2O. 20 O. 40M。所述的特异性鲎试剂的制备方法，其步骤E中的G因子抑制剂是这样配制的在适量纯化水中加入香菇多糖，使其在每毫升G因子抑制剂溶液中的含量为15mg 30mg。一种采用上文所述的特异性鲎试剂的制备方法制备的特异性鲎试剂。一种血液细菌内毒素检测试剂盒，其组成包括上文所述的特异性鲎试剂、体液处理剂I号、体液处理剂II号、细菌内毒素质控品和检查用水；所述体液处理剂I号是这样配制的分别称取适量氯化钠、缓血酸铵，用适量水溶角军，使每毫升溶液含氯化钠8. 5mg 15mg,含缓血酸铵O. 5 Img,之后调节PH值为5. 5 7. 5 ；所述体液处理剂II号是这样配制的称取适量缓血酸铵，用适量水溶解，使每毫升溶液中含缓血酸铵O. 2mg O. 5mg，之后调节PH值为6. 5 8. O。一种血液中细菌内毒素的检测方法，该检测方法采用上文所述的特异性鲎试剂或血液细菌内毒素检测试剂盒测定血液样本中的细菌内毒素。所述的血液中细菌内毒素的检测方法，用所述特异性鲎试剂或所述血液细菌内毒素检测试剂盒检测血液样本中的细菌内毒素时，检测样本按如下步骤制备①取血液样本，按I :I的体积量加入体液处理剂I号溶液，混匀15秒钟-30秒钟，2000转/分 4500转/分，离心2 10分钟，取上清液，即为血液样本2倍稀释液；②取2倍稀释液，按I: I的体积量加入体液处理剂II号溶液，混匀15秒钟-30秒钟，移至70 90°C条件下水浴加热5分钟 10分钟，恒温结束，在2000转/分 4500转/分，离心2 10分钟，制得4倍稀释液备用；③取4倍稀释液的上清液，按体积比I : I加入检查用水，混匀，制得8倍稀释液，即检测样本。所述血液中细菌内毒素的检测方法，其采用的是光度测定法，为动态浊度法或动态显色法。上文所述的特异性鲎试剂或血液细菌内毒素检测试剂盒也可以用于除血液之外的其他体液细菌内毒素的检测，如脑脊液、尿液、腹水、乳汁或病灶组织渗出液的细菌内毒素的检测。本发明提供的技术方案具有如下有益效果I.本发明提供的特异性鲎试剂是一种特异性高的鲎试剂，能消除血液成分，如(I, 3) -β -D-葡聚糖等对鲎试剂反应的干扰，从而实现对体液细菌内毒素的定性和定量检测。2.本发明提供的血液细菌内毒素检测试剂盒中，采用特定的体液处理剂作为辅·剂，用作血液样本的抗凝、稀释、热处理和pH值调节，使血液样本细菌内毒素这种疏水物质可以很好地溶解和分散在反应体系中，提高检测结果的可靠性。3.本发明提供的检测方法，以血液样本为例，进行八倍稀释，有利于消除干扰。4.本发明提供的检测方法，一方面采用特异性鲎试剂作为主剂，提高与细菌内毒素反应的光学特异性；同时采用特定的血液样本制备方法，有利于消除干扰；另一方面，在检测过程中，采用外加已知浓度的内毒素标准溶液进行回收率检测试验，可进一步验证检测的准确性，从而确保人体液细菌内毒素检测的可靠性，实现对人体液细菌内毒素的定性、定量检测。5.本发明提供的血液细菌内毒素检测试剂盒和检测方法，其回收率检测试验测得的回收率达86%-140%，比国际标准要求的50%-200%更加准确，而且采用的本法的血液细菌内毒素检测试剂盒，可以简便、快速的进行血液细菌内毒素的检测，在90分钟内可完成10人份血液样本的细菌内毒素的全过程检测，大大提高检测效率。6.采用本发明提供的特异性鲎试剂及细菌内毒素检测试剂盒，通过BET-24A型细菌内毒素测定仪或其它光学仪器进行动态观察，可实现对细菌内毒素的鉴别率达100%。7.采用本发明提供的特异性鲎试剂及细菌内毒素检测试剂盒进行检测，具有检测灵敏度高、细菌内毒素检测范围大的特点，达0.005EU/ml 100EU/ml ；
图I :细菌内毒素与β -D-葡聚糖光密度曲线的比较图。图2:标准曲线图。图3 :制作标准曲线时各实验组反应的光密度曲线图。图4 :检测样本及各对照组的光密度曲线中所示的OD值是指光密度值，检测波长450nm。
具体实施例方式本发明提供的技术方案，其原理是利用本发明提供的特异性鲎试剂的C因子被体液样本中的微量细菌内毒素激活，而产生生物化学反应，在光学仪器恒温(36-38°C )观察，利用细菌内毒素浓度越大，反应时间越短的相关性，将细菌内毒素浓度(C)和反应时间(T)分别取对数进行回归分析(LgT=a+bLgC)，计算被测体液样本中的细菌内毒素含量。并通过光密度曲线和反应速率，鉴别与本发明提供的试剂反应的细菌内毒素和/或(1，3)-β D葡聚糖物质，在此基础上实现对细菌内毒素的定性定量检测。参见图1，该图为本发明提供的特异性鲎试剂分别与细菌内毒素和β-D葡聚糖标准溶液，在同一时间反应的光密度曲线图，结合反应速率，可观察到细菌内毒素反应的光密度曲线呈“S”型，而葡聚糖反应的曲线呈“斜线”，从而可通过光密度曲线和反应速率，鉴别与特异性鲎试剂发生反应的是细菌内毒素还是β-D葡聚糖，实现定性鉴别。本发明提供的血液细菌内毒素检测试剂盒，由特异性鲎试剂、体液处理剂I号、体液处理剂II号、细菌内毒素质控品和检查用水组成。其制备方法详述如下I.特异性當试剂采用如下步骤制备步骤A-采血将新鲜活鲎用酒精消毒心门并采血；加入抗凝剂，其与鲎血的体积比为1:6 I :10 ;
所述抗凝剂是向适量纯化水中加入预配好的辅料溶液，使每IOOml溶液中含咖啡因或茶碱O. 015Μ O. 04Μ,含NaClO. 15Μ O. 35Μ,过滤分装，用流通蒸汽消毒30 40分
钟即可。步骤B分离细胞将鲎血移至离心瓶内，在750-850转/分的速度下离心分离，
弃血清；步骤C裂解细胞将步骤B余下的鲎血细胞移至洁净的收集瓶内，按鲎血细胞体积的40%-50%的量加入细胞裂解液，裂解细胞得鲎血细胞溶解物；所述细胞裂解液是向纯化水中加入O. 05M/ml的Tris-HCl溶液适量，调PH值为6. O 8. O,用流通蒸汽消毒30 40分钟而制得。步骤D分离细胞壁按照与鲎血细胞溶解物的体积比为1:0. 8 1:1.2的量向鲎血细胞溶解物中加入氯仿，并加入聚乙二醇8 O O O，使所形成的混合溶液中的聚乙二醇8000的浓度为I. 5 3mg/ml,随即混合45 60分钟,然后移至离心机离心3040分钟(1500 3000转/分)，分离提取物，制得含有C因子、凝固酶和凝固酶原活性成分的鲎试剂原液。步骤E-加入促活剂及G因子抑制剂，配制半成品按鲎试剂原液体积与促活剂体积比为1:0. 15 1:0. 30的比例加入预先调配好的促活剂，按照鲎试剂原液体积与G因子抑制剂体积比为1:0. 25 1:0. 50的比例加入G因子抑制剂，搅拌均匀，制成鲎试剂半成
品O所述促活剂是在适量的纯化水中加入KCl ,MgSO4或CaCl2溶液，使每毫升促活剂含KCl O. 15 O. 30M,含MgSO4O. 15 O. 30M或含CaCl2O. 20 O. 40M,过滤分装，用流通蒸汽
消毒30 40分钟即可。所述G因子抑制剂是在适量纯化水中加入香菇多糖，使其在每毫升G因子抑制剂溶液中的含量为15mg 30mg,过滤分装,用流通蒸汽消毒30 40分钟即可。步骤F灌装、冷冻干燥和封口 鲎试剂半成品预检后，分装，在_45°C _55°C真空冷冻干燥，之后在20-25°C封口，制得特异性鲎试剂成品。2.体液处理剂I号是这样配制的分别称取适量氯化钠、缓血酸铵，加入投料容器内，添加适量水溶解,使每毫升溶液含氯化钠8. 5mg 15mg，含缓血酸铵O. 5 lmg，用稀盐酸调节PH值为5. 5 7. 5,混合均勻后,过滤分装,用流通蒸汽消毒30 40分钟即可；体液处理剂II号是这样配制的称取适量缓血酸铵加入投料容器内，添加水适量溶解，使每毫升溶液中含缓血酸铵O. 2mg O. 5mg,用稀盐酸调节PH值为6. 5 8. 0，混合均匀后过滤分装，用流通蒸汽消毒30 40分钟即可；3.细菌内毒素质控品是这样制备的采用细菌内毒素标准品(国家标准品)，将其稀释到一定浓度(根据实际情况而定，如20EU/ml、10EU/ml、0. 50EU/ml),混合均匀后，分装，-45°C -55°C真空冷冻干燥，之后在20-25°C封口即得成品；4.检查用水为注射用水的重蒸馏水，分装、灭菌后，经检测合格后即可(按《中国药典》标准检测)。
实施例f实施例9采用上文所述的制备方法制备特异性鲎试剂及血液细菌内毒素检测试剂盒，各个实施例在制备特异性鲎试剂及血液细菌内毒素检测试剂盒时所采用的相关参数见表表4。表I.各实施例在特异性鲎试剂制备步骤A、步骤D、步骤E中的相关参数
权利要求
1.一种特异性鲎试剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤 A.采血，加入与鲎血的体积比为1:6 1:10的抗凝剂； B.分离细胞将鲎血移至离心瓶内，在750-850转/分的速度下离心分离，弃血清； C.裂解细胞将步骤B余下的鲎血细胞移至收集瓶内，按鲎血细胞体积的40%-50%的量加入细胞裂解液，裂解细胞得鲎血细胞溶解物； D.分离细胞壁按照与鲎血细胞溶解物的体积比为1:0.8 1:1. 2的量向鲎血细胞溶解物中加入氯仿，并加入适量聚乙二醇8000，随即混合形成混合溶液，然后离心，分离提取物，制得鲎试剂原液。
E.加入促活剂及G因子抑制剂，配制半成品按鲎试剂原液体积与促活剂体积比为I: O. 15 I: O. 30的比例加入预先调配好的促活剂，按照鲎试剂原液体积与G因子抑制剂体积比为1:0. 25 1:0. 50的比例加入G因子抑制剂，搅匀，制成鲎试剂半成品。
F.灌装、冷冻干燥和封口，制得特异性鲎试剂成品。
2.根据权利要求I所述的特异性鲎试剂的制备方法，其特征在于，步骤A中的抗凝剂是这样配制的向适量纯化水中加入预配好的辅料溶液，使每IOOml溶液中含咖啡因或茶碱O.015M O. 04M,含 NaClO. 15M O. 35M。
3.根据权利要求I所述的特异性鲎试剂的制备方法，其特征在于，步骤C中的细胞裂解液是这样配制的向纯化水中加入O. 05M/ml的Tris-HCl溶液，调PH值为6. O 8. O。
4.根据权利要求I所述的特异性鲎试剂的制备方法，其特征在于，步骤D中的聚乙二醇8000在所述混合溶液中的浓度为I. 5 3mg/ml。
5.根据权利要求I所述的特异性鲎试剂的制备方法，其特征在于，步骤E中的促活剂是这样配制的在适量纯化水中加入KCUMgSO4或CaCl2溶液，使每毫升促活剂含KCl O. 15 O.30M,含 MgSO4O. 15 O. 30M 或含 CaCl2O. 20 O. 40M。
6.根据权利要求I所述的特异性鲎试剂的制备方法，其特征在于，步骤E中的G因子抑制剂是这样配制的在适量纯化水中加入香菇多糖，使其在每毫升G因子抑制剂溶液中的含量为15mg 30mg。
7.一种采用权利要求I飞任一项所述的特异性鲎试剂的制备方法制备的特异性鲎试剂。
8.一种血液细菌内毒素检测试剂盒，其特征在于，其组成包括权利要求7所述的特异性鲎试剂、体液处理剂I号、体液处理剂II号、细菌内毒素质控品和检查用水； 所述体液处理剂I号是这样配制的分别称取适量氯化钠、缓血酸铵，用适量水溶解，使每毫升溶液含氯化钠8. 5mg 15mg，含缓血酸铵O. 5 lmg，之后调节PH值为5. 5 7. 5 ; 所述体液处理剂II号是这样配制的称取适量缓血酸铵，用适量水溶解，使每毫升溶液中含缓血酸铵O. 2mg O. 5mg，之后调节PH值为6. 5 8. O。
9.一种血液中细菌内毒素的检测方法，其特征在于，该检测方法采用权利要求7所述的特异性鲎试剂或权利要求8所述的血液细菌内毒素检测试剂盒测定血液样本中的细菌内毒素。
10.根据权利要求9所述的血液中细菌内毒素的检测方法，其特征在于，用所述特异性鲎试剂或所述血液细菌内毒素检测试剂盒检测血液样本中的细菌内毒素时，检测样本按如下步骤制备①取血液样本，按I: I的体积量加入体液处理剂I号溶液，混匀15秒钟-30秒钟，2000转/分 4500转/分，离心2 10分钟，取上清液，即为血液样本2倍稀释液； ②取2倍稀释液，按I:I的体积量加入体液处理剂II号溶液，混匀15秒钟-30秒钟，移至70 90°C条件下水浴加热5分钟 10分钟，恒温结束，在2000转/分 4500转/分，离心2 10分钟，制得4倍稀释液备用； ③取4倍稀 释液的上清液，按体积比I:1加入检查用水，混匀，制得8倍稀释液，即检测样本。
全文摘要
本发明提供一种特异性鲎试剂及其制备方法，其制备步骤包括采血、分离细胞、裂解细胞、分离细胞壁、加促活剂和G因子抑制剂配制半成品等步骤；本发明还提供一种包括上述的特异性鲎试剂的血液细菌内毒素检测试剂盒，其还包括体液处理剂I号、体液处理剂Ⅱ号、细菌内毒素质控品和检查用水。本发明提供的特异性鲎试剂及检测试剂盒，可以定性鉴别鲎试剂与细菌内毒素和葡聚糖类物质的凝胶反应，从而提高血液细菌内毒素检测结果的可靠性，实现对血液细菌内毒素的定量检测；采用它们进行血液细菌内毒素的检测具有灵敏度高、检测结果可靠和检测效率高的特点。
文档编号G01N21/78GK102901726SQ20121034308
公开日2013年1月30日 申请日期2012年9月14日 优先权日2012年9月14日
发明者莫水晶, 莫世文, 莫世君 申请人:莫水晶, 莫世文, 莫世君